Whole-genome Sequencing and Sequence Analysis of an Aminopeptidase-producing Bacillus subtilis LBJ4-5
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摘要: 本研究从郫县豆瓣中分离获得一株高产氨肽酶菌株B. subtilis LBJ4-5，通过溶血性试验及抗生素敏感性试验评估了其安全性。同时，采用Illumina二代测序技术和第三代高通量Pacbio测序平台对B. subtilis LBJ4-5进行全基因组测序，获得其基因组特征信息，并通过COG、GO、KEGG、CAZY、CARD和VFDB等数据库进行基因预测及功能注释，以及评价其氨肽酶生产性能和安全性。结果显示，B. subtilis LBJ4-5经48 h摇瓶培养后发酵上清中的氨肽酶活达到179.23 U/mL，菌株无溶血活性且对头孢唑林、万古霉素、青霉素G、头孢氨苄等10种抗生素均高度敏感（直径≥20 mm），显示出良好的安全性。B. subtilis LBJ4-5的基因组由一条环状闭合DNA及一个环状质粒组成，大小为4053926 bp，GC含量为43.66%，共预测到4285个蛋白质编码基因、85个tRNA基因、33个rRNA基因、119个sRNA。在COG、GO、KEGG、CAZY、CARD和VFDB数据库中分别注释到3386、2581、2552、144、256和401个功能基因。进一步的信息挖掘分析表明，B. subtilis LBJ4-5的基因组中含有31个氨肽酶编码基因。而毒力基因与耐药性基因的预测分析，进一步证实了B. subtilis LBJ4-5菌株的安全性。综上，B. subtilis LBJ4-5可用作发酵食品加工的发酵菌剂。Abstract: In this study, a high-yield aminopeptidase producing strain, Bacillus subtilis LBJ4-5, was isolated from Pixian Douban, and its safety was evaluated through hemolysis and antibiotic sensitivity tests. Additionally, Illumina second-generation sequencing and PacBio third-generation high-throughput sequencing were employed for the whole-genome sequencing of B. subtilis LBJ4-5 to characterize its genomic features. Gene prediction and functional annotation were carried out using databases such as COG, GO, KEGG, CAZY, CARD and VFDB. Furthermore, the aminopeptidase production capacity and safety of the strain were evaluated.The results showed that after 48 hours of shake flask cultivation, the aminopeptidase activity in the fermentation supernatant of B. subtilis LBJ4-5 reached 179.23 U/mL. The strain showed no hemolytic activity and was highly sensitive (diameter≥20 mm) to 10 antibiotics, including cefazolin, vancomycin, penicillin G, and cefadroxil, indicating a favorable safety profile.The genome of B. subtilis LBJ4-5 consisted of a circular closed DNA and a circular plasmid, with a size of 4053926 bp and a GC content of 43.66%. A total of 4285 protein-coding genes, 85 tRNA genes, 33 rRNA genes, and 119 sRNAs were predicted. Functional gene annotations in COG, GO, KEGG, CAZY, CARD, and VFDB databases identified 3386, 2581, 2552, 144, 256 and 401 functional genes, respectively. Further analysis indicated that the genome of B. subtilis LBJ4-5 contains 31 aminopeptidase-encoding genes. Additionally, the prediction of virulence and antibiotic resistance genes further confirmed the safety of the B. subtilis LBJ4-5 strain. In conclusion, B. subtilis LBJ4-5 can be used as a fermentation starter for the processing of fermented foods.
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氨肽酶（Aminopeptidases，APs）属于外切蛋白酶，具有水解多肽和蛋白质N端释放游离氨基酸的功能[1]。在食品工业和科学研究中，氨肽酶因能提高蛋白水解深度、增加游离氨基酸含量等用途而被广泛应用[2−3]。氨肽酶也被称为风味蛋白酶，其能够改善发酵食品的风味[4]和有效降解苦味肽，释放出具有良好风味特征的肽段及游离氨基酸；同时，还能促进发酵过程，增强发酵食品鲜味。因此，商品化氨肽酶常用作风味调味料制作时的添加剂[5]。但商品化氨肽酶活性易受到高盐浓度抑制，不适合直接添加到豆瓣酱等高盐（18% NaCl）发酵体系中。亟需耐盐、氨肽酶活高且安全性好的食品级微生物菌株应用于此类发酵食品。产氨肽酶的微生物主要包括霉菌、酵母和细菌。相对而言，细菌具有更短的生长周期，在发酵食品生产中更容易成为优势功能菌种[6]。
近年来，全基因组作为一项高效检测技术，已广泛应用于微生物鉴定分类和功能预测等[7]。如Liu等[8]对从大曲中分离的贝莱斯芽孢杆菌DW-7进行全基因组测序和分析，从基因水平证实其具有高产蛋白酶活性潜力，并分析了其氨基酸代谢途径。Santhakalaikumari等[9]为阐明B. paralicheniformis MKU3的角蛋白降解机制，对其进行了全基因组测序及蛋白酶编码基因挖掘，确定了参与角蛋白水解的蛋白酶类群。而Jiang等[10]则通过全基因组测序分析，证明了一株分离自云南乌鸡肠粘膜的唾液乳杆菌CGMCC 20700的安全性和益生菌特性。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）属于食品名录菌株，可直接应用于食品加工，并因其卓越的蛋白质分泌能力而被广泛用于食品酶的商业生产[11−12]。豆类发酵食品需要产蛋白酶菌株参与来降解蛋白，是产蛋白酶菌株的资源库。因此，本研究前期从郫县豆瓣酱中筛选获得了一株耐盐、具有高氨肽酶活性的菌株B. subtilis LBJ4-5。为了深入探究B. subtilis LBJ4-5菌株的功能，鉴定其氨肽酶基因并深入挖掘其他功能基因，本研究对B. subtilis LBJ4-5进行了全基因组测序，并利用COG、GO、KEGG、CAZY、CARD和VFDB等数据库进行了功能基因的注释，验证了B. subtilis LBJ4-5基因组中携带较多氨肽酶功能基因。此外，通过毒力与耐药性基因预测及安全性测试，对B. subtilis LBJ4-5的安全性进行了评估，为该菌株进一步开发和利用奠定了理论基础。本研究旨在筛选出适宜发酵食品工业化生产的优良氨肽酶生产菌种。
1. 材料与方法
1.1 材料和仪器
B. subtilis LBJ4-5 分离自郫县豆瓣酱，保藏于国家海洋食品工程技术研究中心微生物菌种库；哥伦比亚琼脂和其他培养基成分 均购自青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌16S通用引物27F和1492R、DL 2000 DNA Marker、Taq MasterMix 购自生工生物工程（上海）有限公司；Wizard®基因组DNA纯化试剂盒 美国Promega公司提供；其他试剂均为分析纯。
Leica DM2500光学显微镜 徳国徕卡仪器有限公司；NanoDrop One DNA浓度测定仪 美国Thermo Scientific公司；S1000 PCR扩增仪 美国BIO-RAD公司；ChemiDoc MP System凝胶成像仪 以色列DNR公司；Infinite M200多功能酶标仪 瑞士TECAN公司；Micro 17R冷冻高速离心机 美国Thermo Scientific公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基配制及菌株培养
氨肽酶筛选培养基（g/L）：蔗糖30.0，牛肉膏1.52，L-亮氨酸-4-硝基苯胺（LNA）0.5，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 1.01，琼脂粉20.2，pH7.0±0.2。B. subtilis LBJ4-5培养条件：平板37 ℃静置培养24 h，菌液37 ℃、200 r/min培养至对数生长期。
1.2.2 菌株氨肽酶活性分析
1.2.2.1 LNA平板分析
采用双层牛津杯法[13]进行LNA平板分析。收集对数生长期B. subtilis LBJ4-5菌液，以4 ℃、8000 r/min的条件离心10 min收集发酵上清，移取50 μL注入平板小孔中，37 ℃静置培养24 h后观察。
1.2.2.2 氨肽酶活性测定
采用LNA法[14]检测氨肽酶活性。具体步骤如下：收集对数生长期B. subtilis LBJ4-5菌液上清，进行适当稀释，取100 μL上清液（以100 ℃煮沸灭活20 min的100 μL发酵上清液作为对照）加入1.5 mL的PBS，在40 ℃恒温水浴10 min，随后加入100 μL浓度为25 mmol/L的LNA，40 ℃温育10 min后，于405 nm测吸光值。实验平行三次。氨肽酶酶活定义：在40 ℃、pH7.2条件下，每分钟水解LNA释放1 μg对硝基苯胺（pNA）所需的酶量为一个酶活力单位。
1.2.3 安全性评价
1.2.3.1 溶血性试验
将B. subtilis LBJ4-5在含有5%脱纤维绵羊血的哥伦比亚板上划线培养，37 ℃温育24 h，观察平板是否有溶血现象。以金黄色葡萄球菌ATCC 25923为溶血阳性对照，益生菌大肠杆菌Nissle 1917[15]作为阴性对照。进行三次平行实验。
1.2.3.2 抗生素敏感性试验
采用纸片扩散法[16]对菌株的抗生素敏感性进行测定。收集对数生长期的B. subtilis LBJ4-5菌液，吸取100 μL涂布于LB平板中，并小心放置庆大霉素（10 μg）、链霉素（10 μg）、红霉素（15 μg）、四环素（30 μg）、头孢氨苄（30 μg）、万古霉素（30 μg）、头孢唑林（30 μg）、氨苄西林（10 μg）、青霉素（10 μg）、米诺环素（30 μg）、阿米卡星（30 μg）11种抗生素药敏纸片，且每个纸片的间距不小于24 mm。静置培养24 h后测量并统计透明圈直径，分析其耐药性抗性R（≤14 mm），中期I（14~20 mm）或敏感S（≥20 mm）。进行三次平行实验。
1.2.4 B. subtilis LBJ4-5的全基因组测序
收集培养至对数生长期的B. subtilis LBJ4-5菌体，进行两次无菌水重悬洗涤。根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，制备B. subtilis LBJ4-5基因组DNA样品，验证样品浓度和纯度合格后，干冰保存并寄送给上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina DNA文库构建，在样本质检合格后，使用Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq6000测序平台进行全基因组测序[17]。
1.2.5 B. subtilis LBJ4-5基因组注释
1.2.5.1 基因组组装
使用Fastp v0.23.0软件对Illumina测序产生的原始数据进行质量控制和剪切，然后使用Unicycler v0.4.8[18]对经过质控的Illumina数据和Nanopore数据进行混合组装，并借助Pilon v1.22和SOAPdenovo2.04软件对组装结果进行进一步序列优化和矫正，得到最终的组装基因组。
1.2.5.2 基因预测
利用Prodigal软件预测B. subtilis LBJ4-5染色体基因组，使用GeneMarkS软件预测B. subtilis LBJ4-5质粒基因组[19]。经过预测分析，获得功能基因的核酸序列和其对应功能蛋白的氨基酸序列。
1.2.5.3 基因组圈图绘制
通过CGView软件[20]，初步绘制B. subtilis LBJ4-5基因组圈图，全面展示B. subtilis LBJ4-5基因组的特征，包括正义链和负义链上的基因、COG功能分类情况、GC含量以及基因组大小等信息。
1.2.5.4 基因功能注释
在此基础上使用Diamond、blast2go和hmmer3等软件，将预测得到的B. subtilis LBJ4-5的蛋白质序列与Clusters of Orthologous Groups of proteins（COG）、Gene Ontology（GO）、Non-Redundant Protein Database（NR）、UniProtKB/Swiss-Prot（Swiss-Prot）、Protein Family Analysis and Modeling（Pfam）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）等数据库中的蛋白质序列进行比对，以获得B. subtilis LBJ4-5基因功能的注释信息。
1.2.5.5 毒力及耐药基因预测
利用Diamond比对软件，设定E-value为1e-5，将预测的B. subtilis LBJ4-5基因序列分别与Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）数据库和Virulence Factors Database（VFDB）数据库中的序列进行比对，以识别可能导致B. subtilis LBJ4-5耐药的基因及可能携带的毒力基因情况[21−22]。根据农业农村部发布的《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》要求[23]，本研究设定氨基酸序列identity≥80%和coverage≥70%的筛选阈值，旨在甄别出B. subtilis LBJ4-5可携带的耐药基因和毒力基因。
1.2.6 B. subtilis LBJ4-5氨肽酶基因预测
采用NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO、KEGG等数据库，深入挖掘并分析B. subtilis LBJ4-5基因组中与氨肽酶相关功能基因，如编码丝氨酸氨肽酶基因、编码金属氨肽酶基因及编码亮氨酸氨肽酶基因等[24]。
1.3 数据处理
所有试验均重复三次，数值表示为平均值±SD（n=3）。利用Excel 2021分析处理数据；使用Origin 2021软件（OriginLab Corp，USA）绘制作图；采用SPSS 20.0软件（International Business Machines Corp，USA）进行数据统计及显著性差异分析。
2. 结果与分析
2.1 氨肽酶活性试验
无色的LNA在氨肽酶作用下会分解生成肉眼可见的黄色的pNA[25]。由图1可知，B. subtilis LBJ4-5的发酵上清液在LNA平板上会形成黄色的水解圈，平均直径为23.8 mm，表明B. subtilis LBJ4-5发酵上清液具有氨肽酶活性。为进一步评价B. subtilis LBJ4-5的氨肽酶酶活，利用LNA法，测得摇瓶培养48 h的B. subtilis LBJ4-5发酵上清中酶活力为179.23 U/mL。有研究报道，Xi等[2]将枯草芽孢杆菌zj016的氨基肽酶基因在毕赤酵母中异源表达，甲醇诱导96 h后，酶活达到28.4 U/mL。孟广超[14]利用米曲霉菌株CICC2066发酵，测得发酵48 h时氨肽酶酶活达到150 U/mL。上述报道均低于本文测得的B. subtilis LBJ4-5氨肽酶酶活。同时本文筛选测定酶活的菌株为B. subtilis LBJ4-5，芽孢杆菌本身就具有生长周期短，代谢能力强等优点，这使得氨肽酶菌株B. subtilis LBJ4-5具有应用价值。
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图 1 B. subtilis LBJ4-5培养上清液的LNA平板水解圈照片Figure 1. Photograph of LNA plate hydrolysis circles of B. subtilis LBJ4-5 supernatant2.2 B. subtilis LBJ4-5安全性
不同菌株之间存在较大的遗传差异，即使属于同一种属，其表型也可能有显著差异。因此，对每个菌株进行安全性评估非常重要，这种严格的检测和评估将明确菌株的使用效果并排除风险因素[26]。本研究对B. subtilis LBJ4-5进行了安全性评价。研究表明溶血素与菌株致病性和毒性相关，作为菌株安全性评价的重要指标，排除溶血性是菌株安全性评价首选试验 [27−28]。溶血性分为α溶血、β溶血及γ溶血，α溶血和β溶血分别表现为有绿棕色溶血圈和完全透明溶血圈，而γ溶血则表现无溶血圈即不溶血[29]。溶血实验的结果如图2所示，B. subtilis LBJ4-5在哥伦比亚血平板上培养24 h后，菌落周围没有溶血现象，初步判定B. subtilis LBJ4-5为安全菌株，而对照菌株S. aureus ATCC 25923则呈明显的β-溶血现象，益生菌E. coli Nissle 1917显现α-溶血现象。目前抗生素耐药性问题引发的危害已经越来越严重，作为食品发酵剂，新分离菌株的抗生素敏感试验，也是新菌株安全性评价的重要内容[30]。从抗生素敏感性检测结果（表1）可知，B. subtilis LBJ4-5对头孢唑林、万古霉素、红霉素、青霉素G、头孢氨苄、链霉素、阿米卡星、四环素、米诺环素、庆大霉素等常用抗生素均高度敏感（直径≥20 mm），进一步验证了B. subtilis LBJ4-5具有良好的安全性。
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图 2 B. subtilis LBJ 4-5溶血性活性分析结果Figure 2. Results of hemolytic activity analysis of B. subtilis LBJ 4-5表 1 B. subtilis LBJ 4-5的抗生素敏感性试验结果Table 1. Results of antibiotic sensitivity experiments of Bacillus subtilis LBJ4-5抗生素 抑制圈直径（mm） 敏感度等级 链霉素 23.15±0.92 S 头孢唑林 36.40±0.79 S 四环素 33.03±1.04 S 阿米卡星 22.10±0.23 S 米诺环素 30.13±0.29 S 庆大霉素 23.87±0.78 S 头孢氨苄 38.87±0.60 S 万古霉素 22.92±0.36 S 红霉素 32.33±0.21 S 青霉素G 27.96±0.36 S 2.3 B. subtilis LBJ4-5基因组组成与信息
B. subtilis LBJ4-5的基因组全长为4053926 bp，GC含量为43.66%。有一条环状闭合基因组（大小为4047022 bp，GC含量为43.67%）（图3）和一个环状质粒（大小为6904 bp，GC含量为39.50%）（图略），B. subtilis LBJ4-5的蛋白质编码基因4285个，tRNA基因85个、rRNA基因33个、sRNA基因119个。
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图 3 B. subtilis LBJ 4-5的全基因组图谱注：圈图从外到内第一圈和第四圈为正链、负链上的CDS，不同的颜色表示不同COG功能分类；第二圈和第三圈分别为正链、负链上的CDS、tRNA、rRNA；第五圈为GC含量；第六圈为GC-Skew值；最内一圈为基因组大小标识。Figure 3. Whole genome map of B. subtilis LBJ 4-5B. subtilis LBJ4-5的编码基因的平均长度为829.33 bp，其中，最小基因仅为90 bp，最长基因则有10764 bp。长度>500 bp的基因有2849个，长度>1000 bp的基因有1286个；串联重复序列为26个，重复比例为0.13%；散在重复序列为30个，重复比例为0.06%（表2）。
表 2 B. subtilis LBJ 4-5基因组统计Table 2. Genome statistics of B. subtilis LBJ 4-5类型 基因长度（bp） 数量（个） 重复比例（%） 基因平均长度 829.33 − − 最短基因长度 90 − − 最长基因长度 7137 − − 长度>500 bp − 2849 − 长度>1000 bp − 1286 − 串联重复序列 − 26 0.13 散在重复序列 − 30 0.06 注：“−”表示未检出。 2.4 B. subtilis LBJ4-5基因功能注释
对预测得到的B. subtilis LBJ4-5编码基因进行了功能注释。如图4所示，B. subtilis LBJ4-5在NR数据库、Swiss-Prot数据库、Pfam数据库、COG数据库、GO数据库和KEGG数据库中分别注释到4280、3913、3704、3386、2581和2552个基因。后续本文仅展示了三种普遍常用的COG、GO和KEGG数据库对B. subtilis LBJ4-5进行详细的基因功能注释，其结果已经能够解释该菌株可能具有高氨肽酶能力的原因。
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图 4 B. subtilis LBJ 4-5基因功能注释统计图Figure 4. Functional annotation statistics of B. subtilis LBJ 4-5 gene2.4.1 COG 数据库注释
将蛋白序列注释到COG数据库，可推测其相应功能。根据COG数据库注释结果（图5），B. subtilis LBJ4-5共有3386个编码基因被注释到23个COG条目中。根据注释结果，参与氨基酸转运和代谢（E：Amino acid transport and metabolism）的基因最多，共有317个基因（占注释基因总数的9.36%）；其次，参与转录（K：Transcription）的基因有312个（占注释基因总数的9.21%）；排在第三位的是参与碳水化合物运输和代谢（G：Carbohydrate transport and metabolism），有309个基因（占注释基因总数的9.13%）；仅具有通用功能预测（R：General function prediction only）的基因有280个（占比为8.27%）。基于以上注释结果，说明B. subtilis LBJ4-5具有强大的碳水化合物代谢能力、基因表达和蛋白质合成及转运的能力。
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图 5 B. subtilis LBJ 4-5 COG 注释分类Figure 5. Classification of B. subtilis LBJ 4-5 COG annotations2.4.2 GO 数据库注释
B. subtilis LBJ4-5在GO数据库注释统计结果如图6所示。共有2581个功能基因得到注释，其中2031个基因被注释到分子功能（molecular function，MF），1588个基因被注释到生物过程（biological process，BP），1490个基因被注释到细胞组分（cellular component，CC）。在分子功能方面，参与ATP结合（ATP binding）和DNA结合（DNA binding）的功能基因最多，分别有304个基因（占注释分子功能基因数量的14.97%）和294个基因（占注释分子功能基因数量的14.48%）。在生物过程方面，参与孢子形成和DNA模板转录的调控功能基因占比最高，分别有148个（占注释生物过程基因数量的9.32%）和93个（占注释生物过程基因数量的5.86%）。在细胞组分方面，膜的组成部分和质膜功能基因占比最高，分别有728个（占注释细胞组分基因数量的48.86%）和535个（占注释细胞组分基因数量的35.91%）。
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图 6 B. subtilis LBJ 4-5 GO注释分类Figure 6. Classification of B. subtilis LBJ 4-5 GO annotations2.4.3 KEGG数据库注释
将B. subtilis LBJ4-5基因组数据与KEGG数据库进行比对和统计分析，结果如图7所示。共有2552个基因获得了注释，并根据功能分为六类代谢途径。注释结果显示，B. subtilis LBJ4-5参与新陈代谢、环境信息处理、遗传信息处理、细胞过程、人类疾病和有机系统六个功能类别的基因分别为1905、328、195、187、113和55个。其中，新陈代谢基因数量最多，共计1905个。在新陈代谢基因中，全局图谱和总览图谱的基因丰度最高，共注释到743个基因。其次是碳水化合物代谢（277个基因）、氨基酸代谢（205个基因）、辅助因子和维生素代谢（162个基因）以及能量代谢（107个基因）。在环境信息处理基因中，膜运输基因的丰度最高，共注释到166个基因。在遗传信息处理基因中，翻译基因的比例最高，共注释到85个基因。这些注释结果表明，B. subtilis LBJ4-5在碳代谢、蛋白质代谢和物质转运方面具有遗传优势，因而B. subtilis LBJ4-5可能具有较强的物质代谢和物质转运能力，这为B. subtilis LBJ4-5降解原料中大分子物质产生多种多样的代谢功能成分提供了可能。
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图 7 B. subtilis LBJ 4-5 KEGG 注释分类Figure 7. Classification of B. subtilis LBJ 4-5 KEGG annotations2.4.4 CARD数据库注释
目前广泛使用的细菌耐药基因数据库是CARD数据库[31]。将序列identity设定为≥80%，Coverage设定为≥70%作为筛选条件，通过CARD数据库注释，获得了B. subtilis LBJ4-5基因组中可能携带的耐药基因相关信息。B. subtilis LBJ4-5的CARD注释结果如表3所示。
表 3 B. subtilis LBJ 4-5 CARD 注释结果Table 3. Results of B. subtilis LBJ 4-5 CARD annotation基因编号 抗性基因类型 抗生素耐药性 机理 一致性（%） gene 0135 Bacillus subtilis rpoB mutants conferring resistance to rifampin peptide antibiotic; rifamycin antibiotic antibiotic target alteration;antibiotic target replacement 100.0 gene 0141 Enterococcus faecium EF-Tu mutants conferring resistance to GE2270A elfamycin antibiotic antibiotic target alteration 87.8 gene 0387 mphK macrolide antibiotic antibiotic inactivation 97.8 gene 0388 mphK macrolide antibiotic antibiotic inactivation 96.7 gene 0389 mphK macrolide antibiotic antibiotic inactivation 96.6 gene 0404 lmrB lincosamide antibiotic antibiotic efflux 99.0 gene 0451 tmrB nucleoside antibiotic reduced permeability to antibiotic 90.9 gene 1024 Bacillus subtilis mprF peptide antibiotic antibiotic target alteration 99.9 gene 1512 ykkC aminoglycoside antibiotic; phenicol antibiotic; tetracycline antibiotic antibiotic efflux 99.1 gene 1513 ykkD aminoglycoside antibiotic; phenicol antibiotic; tetracycline antibiotic antibiotic efflux 98.1 gene 2482 bmr disinfecting agents and antiseptics; fluoroquinolone antibiotic; nucleoside antibiotic; phenicol antibiotic antibiotic efflux 99.5 根据表3，B. subtilis LBJ4-5的基因组中可能存在11个耐药基因，其中包括Bacillus subtilis rpoB mutants conferring resistance to rifampin、ykkC、ykkD、bmr等基因，这些基因可能具有多重耐药性，推测B. subtilis LBJ4-5可能具有一定耐药性[32]。然而，根据抗生素药敏纸片实验结果显示，B. subtilis LBJ4-5对10种常用抗生素药敏纸片均表现出高度敏感。因此，B. subtilis LBJ4-5有耐药性基因但没有耐受性表型的机制值得后续研究。
2.4.5 VFDB数据库注释
VFDB数据库是一个较全面的病原菌毒力因子信息管理网络数据库。毒力因子主要包括细菌毒素、粘附相关的细胞表面蛋白、菌体保护性蛋白、胞外碳水化合物和水解酶等[33]。将序列identity设定为≥80%，coverage设定为≥70%作为筛选条件，基于VFDB核心数据库，获得了B. subtilis LBJ4-5基因组中可能携带的毒力因子基因数据。B. subtilis LBJ4-5的VFDB注释结果如表4所示。根据筛选条件，发现B. subtilis LBJ4-5基因组中有1个毒力因子编号基因BslA（VF0411），然而其功能尚未知晓，需要进一步研究来探索。同时对B. subtilis LBJ4-5的溶血性毒力因子进行检索，发现B. subtilis LBJ4-5中没有溶血性毒力因子，这与B. subtilis LBJ4-5溶血性实验结果（图2）相吻合。
表 4 B. subtilis LBJ 4-5 VFDB注释结果Table 4. Results of B. subtilis LBJ 4-5 VFDB annotation基因编号 毒力因子编号 基因名 描述信息 一致性（%） S值可靠性评估 gene 3282 VFG045350
（gb|NP_390986）BslA（VF0411） − 100 6.50E-95 2.5 B. subtilis LBJ4-5编码氨肽酶基因预测分析
B. subtilis LBJ4-5的全基因组序列分别通过NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO、KEGG等数据库进行预测分析，在NR数据库中注释到7个氨肽酶相关基因；在Swiss-Prot数据库中注释到13个氨肽酶相关基因；在Pfam数据库中注释到22个氨肽酶相关基因；在COG数据库中注释到12个氨肽酶相关基因；在GO数据库中注释到11个氨肽酶相关基因；在KEGG数据库中注释到8个氨肽酶相关基因。综合分析以上所有数据库结果如表5所示，发现B. subtilis LBJ4-5的全基因组序列中可能含有31个氨肽酶相关基因。其中注释编码丝氨酸氨肽酶基因数量最多，共14个编号分别为gene 0142、gene 0463、gene 0495、gene 0508、gene 0813、gene 1045、gene 1289、gene 2438、gene 2457、gene 3200、gene 3229、gene 3326、gene3626、gene 3628、gene 3684，它们属于α/β水解酶超家族。目前α/β水解酶超家族正朝着一类结构具有相关性但功能具有差异的酶类发展，该家族主要包括：脂酶、蛋白酶、酯酶等，在代谢途径中能发挥重要作用[34−35]。其次，注释到的编码金属氨基肽酶M42家族基因7个，分别为gene 0166、gene 0950、gene 1222、gene 1609、gene 2543、gene 3036、gene 3132。除此之外，还注释到脯氨酸寡肽酶家族的编码基因gene 3207、gene 3430，亮氨酸氨肽酶编码基因gene 3390，未知功能域基因gene 3718等其他氨肽酶功能基因。来源于多个家族的B. subtilis LBJ4-5氨基肽酶可将肽更高效降解为寡肽或氨基酸，能够实现氮源的快速获取和利用[36]，为B. subtilis LBJ4-5作为原籍菌株回添加至郫县豆瓣发酵工艺、高效释放游离氨基酸的机制研究奠定了坚实的基础。由于亮氨酸氨肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP）底物谱较广，适合复杂的发酵样品肽底物组成，可产生较多的游离氨基酸[37]。作者后期会对亮氨酸氨肽酶进一步研究。综上，本研究从生化水平证明B. subtilis LBJ4-5具有氨肽酶活性，并从基因层面验证了该菌株具有合成并分泌氨肽酶的潜力。
表 5 B. subtilis LBJ 4-5 氨肽酶相关基因及功能注释汇总表Table 5. B. subtilis LBJ 4-5 aminopeptidase related genes and functional annotation table基因编号 基因名 基因长度（bp） 注释 gene 0142 − 957 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 0166 map 747 I型甲氧基氨基肽酶；金属肽酶家族M24 gene 0463 − 864 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 0495 srfATE 729 表面活性素生物合成硫酯酶SrfAD；硫酯酶结构域；α/β水解酶超家族；丝氨酸氨肽酶，S33 gene 0508 − 846 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 0813 cpo 816 α/β水解酶家族；丝氨酸氨肽酶，S33；Ndr家族 gene 0950 map 750 I型甲氧基氨基肽酶；金属肽酶家族M24 gene 1045 − 861 环氧化物水解酶EphM；丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 1222 yhfE 1041 M42家族金属肽酶；谷氨酰氨基肽酶； gene 1289 cpo 807 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族；TAP样蛋白 gene 1494 dppA1 825 D-氨基肽酶DppA gene 1609 pepQ 1095 二肽酶/三肽酶；金属肽酶家族M24；肌酸酐酶/脯氨酸N-末端结构域 gene 1670 ampS 1233 氨肽酶；嗜热金属蛋白酶（M29） gene 2438 − 918 α/β水解酶；丝氨酸氨肽酶，S33；X-Pro二肽基肽酶（S15家族）；脯氨酸寡肽酶家族 gene 2457 − 762 α/β水解酶；丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 2470 pepT 1116 M42谷氨酰氨基肽酶；肽酶二聚结构域；肽酶家族M28 gene 2543 pepP 1062 氨基肽酶PapA；金属肽酶家族M24；肌酸酐酶/脯氨酸N-末端结构域 gene 3036 − 1086 M42家族金属肽酶；M42谷氨酰氨基肽酶；肽酶家族M20/M25/M40 gene 3132 pepA 1074 M42家族金属肽酶；M42谷氨酰氨基肽酶 gene 3200 pldB 780 磷脂酶YtpA；丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族；α/β水解酶折叠 gene 3207 − 774 脯氨酰寡肽酶家族丝氨酸肽酶；脯氨酸寡肽酶家族；BD-FAE；双内内酯水解酶家族；BAAT/酰基辅酶A硫酯水解酶C末端；丝氨酸水解酶（FSH1） gene 3229 menH 825 2-丁酰基-6-羟基-2,4-环己二烯-1-羧酸合酶；α/β水解酶超家族；丝氨酸氨肽酶，S33；Ndr家族 gene 3326 − 822 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族；硫酯酶结构域；推定酯酶；TAP样蛋白 gene 3390 pepA 1503 亮氨酸氨肽酶；细胞质氨肽酶家族，催化结构域；胞浆氨肽酶家族，N-末端结构域 gene3430 − 1974 S9家族肽酶；脯氨酸寡肽酶家族；类似WD40贝塔螺旋桨重复；二肽基肽酶IV（DPP-IV）N-末端区；BD-FAE；乙酰木聚糖酯酶（AXE1）；双内内酯水解酶家族 gene3626 yvaK 741 羧酸酯酶；丝氨酸氨肽酶，S33 gene3628 − 774 α/β水解酶；丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene3684 rsbQ 810 σ因子SigB/磷酸酶RsbP调节因子RsbQ；α/β水解酶超家族；α/β水解酶倍数；丝氨酸氨肽酶，S33 gene3718 − 1356 丝氨酸水解酶；β-内酰胺酶；未知功能域（DUF3471） gene4121 ywaD 1368 氨肽酶YwaD；肽酶家族M28；PA域 gene4168 pepT 1233 肽酶T；肽酶家族M20/M25/M40；肽酶二聚结构域 3. 结论
本研究从郫县豆瓣中分离获得的B. subtilis LBJ4-5，具有良好的氨肽酶生产性能，经48 h摇瓶发酵，其氨肽酶活可达179.23 U/mL。同时验证了该菌株无溶血活性，对头孢唑林、万古霉素、红霉素等10种常用抗生素均高度敏感（直径≥20 mm），无耐药性，初步判定其安全性较好。为进一步分析该菌株产生良好风味和安全性的遗传基础，将B. subtilis LBJ4-5进行了全基因组测序、功能注释、CARD数据库和VFDB数据库检索。结果表明，B. subtilis LBJ4-5的基因组大小为4053926 bp，GC含量为43.66%，预测得到4285个蛋白质编码基因。综合多个数据库分析结果，发现B. subtilis LBJ4-5中存在31个与氨肽酶相关的基因，这从基因层面证实了其强大的氨肽酶产生能力。同时发现，B. subtilis LBJ4-5基因组中没有溶血基因，虽携带少数的耐药基因和1个毒力因子基因，但结合溶血试验和抗生素敏感性试验结果，证明该菌株仍具有良好的安全性。综上，B. subtilis LBJ4-5是一株具有高氨肽酶活性和良好安全性的潜在优良发酵剂。
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图 1 B. subtilis LBJ4-5培养上清液的LNA平板水解圈照片
Figure 1. Photograph of LNA plate hydrolysis circles of B. subtilis LBJ4-5 supernatant
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图 2 B. subtilis LBJ 4-5溶血性活性分析结果
Figure 2. Results of hemolytic activity analysis of B. subtilis LBJ 4-5
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图 3 B. subtilis LBJ 4-5的全基因组图谱
注：圈图从外到内第一圈和第四圈为正链、负链上的CDS，不同的颜色表示不同COG功能分类；第二圈和第三圈分别为正链、负链上的CDS、tRNA、rRNA；第五圈为GC含量；第六圈为GC-Skew值；最内一圈为基因组大小标识。
Figure 3. Whole genome map of B. subtilis LBJ 4-5
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图 4 B. subtilis LBJ 4-5基因功能注释统计图
Figure 4. Functional annotation statistics of B. subtilis LBJ 4-5 gene
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图 5 B. subtilis LBJ 4-5 COG 注释分类
Figure 5. Classification of B. subtilis LBJ 4-5 COG annotations
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图 6 B. subtilis LBJ 4-5 GO注释分类
Figure 6. Classification of B. subtilis LBJ 4-5 GO annotations
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图 7 B. subtilis LBJ 4-5 KEGG 注释分类
Figure 7. Classification of B. subtilis LBJ 4-5 KEGG annotations
表 1 B. subtilis LBJ 4-5的抗生素敏感性试验结果
Table 1 Results of antibiotic sensitivity experiments of Bacillus subtilis LBJ4-5
抗生素 抑制圈直径（mm） 敏感度等级 链霉素 23.15±0.92 S 头孢唑林 36.40±0.79 S 四环素 33.03±1.04 S 阿米卡星 22.10±0.23 S 米诺环素 30.13±0.29 S 庆大霉素 23.87±0.78 S 头孢氨苄 38.87±0.60 S 万古霉素 22.92±0.36 S 红霉素 32.33±0.21 S 青霉素G 27.96±0.36 S 
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表 2 B. subtilis LBJ 4-5基因组统计
Table 2 Genome statistics of B. subtilis LBJ 4-5
类型 基因长度（bp） 数量（个） 重复比例（%） 基因平均长度 829.33 − − 最短基因长度 90 − − 最长基因长度 7137 − − 长度>500 bp − 2849 − 长度>1000 bp − 1286 − 串联重复序列 − 26 0.13 散在重复序列 − 30 0.06 注：“−”表示未检出。
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表 3 B. subtilis LBJ 4-5 CARD 注释结果
Table 3 Results of B. subtilis LBJ 4-5 CARD annotation
基因编号 抗性基因类型 抗生素耐药性 机理 一致性（%） gene 0135 Bacillus subtilis rpoB mutants conferring resistance to rifampin peptide antibiotic; rifamycin antibiotic antibiotic target alteration;antibiotic target replacement 100.0 gene 0141 Enterococcus faecium EF-Tu mutants conferring resistance to GE2270A elfamycin antibiotic antibiotic target alteration 87.8 gene 0387 mphK macrolide antibiotic antibiotic inactivation 97.8 gene 0388 mphK macrolide antibiotic antibiotic inactivation 96.7 gene 0389 mphK macrolide antibiotic antibiotic inactivation 96.6 gene 0404 lmrB lincosamide antibiotic antibiotic efflux 99.0 gene 0451 tmrB nucleoside antibiotic reduced permeability to antibiotic 90.9 gene 1024 Bacillus subtilis mprF peptide antibiotic antibiotic target alteration 99.9 gene 1512 ykkC aminoglycoside antibiotic; phenicol antibiotic; tetracycline antibiotic antibiotic efflux 99.1 gene 1513 ykkD aminoglycoside antibiotic; phenicol antibiotic; tetracycline antibiotic antibiotic efflux 98.1 gene 2482 bmr disinfecting agents and antiseptics; fluoroquinolone antibiotic; nucleoside antibiotic; phenicol antibiotic antibiotic efflux 99.5
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表 4 B. subtilis LBJ 4-5 VFDB注释结果
Table 4 Results of B. subtilis LBJ 4-5 VFDB annotation
基因编号 毒力因子编号 基因名 描述信息 一致性（%） S值可靠性评估 gene 3282 VFG045350
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表 5 B. subtilis LBJ 4-5 氨肽酶相关基因及功能注释汇总表
Table 5 B. subtilis LBJ 4-5 aminopeptidase related genes and functional annotation table
基因编号 基因名 基因长度（bp） 注释 gene 0142 − 957 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 0166 map 747 I型甲氧基氨基肽酶；金属肽酶家族M24 gene 0463 − 864 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 0495 srfATE 729 表面活性素生物合成硫酯酶SrfAD；硫酯酶结构域；α/β水解酶超家族；丝氨酸氨肽酶，S33 gene 0508 − 846 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 0813 cpo 816 α/β水解酶家族；丝氨酸氨肽酶，S33；Ndr家族 gene 0950 map 750 I型甲氧基氨基肽酶；金属肽酶家族M24 gene 1045 − 861 环氧化物水解酶EphM；丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 1222 yhfE 1041 M42家族金属肽酶；谷氨酰氨基肽酶； gene 1289 cpo 807 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族；TAP样蛋白 gene 1494 dppA1 825 D-氨基肽酶DppA gene 1609 pepQ 1095 二肽酶/三肽酶；金属肽酶家族M24；肌酸酐酶/脯氨酸N-末端结构域 gene 1670 ampS 1233 氨肽酶；嗜热金属蛋白酶（M29） gene 2438 − 918 α/β水解酶；丝氨酸氨肽酶，S33；X-Pro二肽基肽酶（S15家族）；脯氨酸寡肽酶家族 gene 2457 − 762 α/β水解酶；丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene 2470 pepT 1116 M42谷氨酰氨基肽酶；肽酶二聚结构域；肽酶家族M28 gene 2543 pepP 1062 氨基肽酶PapA；金属肽酶家族M24；肌酸酐酶/脯氨酸N-末端结构域 gene 3036 − 1086 M42家族金属肽酶；M42谷氨酰氨基肽酶；肽酶家族M20/M25/M40 gene 3132 pepA 1074 M42家族金属肽酶；M42谷氨酰氨基肽酶 gene 3200 pldB 780 磷脂酶YtpA；丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族；α/β水解酶折叠 gene 3207 − 774 脯氨酰寡肽酶家族丝氨酸肽酶；脯氨酸寡肽酶家族；BD-FAE；双内内酯水解酶家族；BAAT/酰基辅酶A硫酯水解酶C末端；丝氨酸水解酶（FSH1） gene 3229 menH 825 2-丁酰基-6-羟基-2,4-环己二烯-1-羧酸合酶；α/β水解酶超家族；丝氨酸氨肽酶，S33；Ndr家族 gene 3326 − 822 丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族；硫酯酶结构域；推定酯酶；TAP样蛋白 gene 3390 pepA 1503 亮氨酸氨肽酶；细胞质氨肽酶家族，催化结构域；胞浆氨肽酶家族，N-末端结构域 gene3430 − 1974 S9家族肽酶；脯氨酸寡肽酶家族；类似WD40贝塔螺旋桨重复；二肽基肽酶IV（DPP-IV）N-末端区；BD-FAE；乙酰木聚糖酯酶（AXE1）；双内内酯水解酶家族 gene3626 yvaK 741 羧酸酯酶；丝氨酸氨肽酶，S33 gene3628 − 774 α/β水解酶；丝氨酸氨肽酶，S33；α/β水解酶超家族 gene3684 rsbQ 810 σ因子SigB/磷酸酶RsbP调节因子RsbQ；α/β水解酶超家族；α/β水解酶倍数；丝氨酸氨肽酶，S33 gene3718 − 1356 丝氨酸水解酶；β-内酰胺酶；未知功能域（DUF3471） gene4121 ywaD 1368 氨肽酶YwaD；肽酶家族M28；PA域 gene4168 pepT 1233 肽酶T；肽酶家族M20/M25/M40；肽酶二聚结构域
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