Relationship between Calcium-binding Ability and Structure of Soybean Protein Based on the Change of Preparation
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摘要: 大豆蛋白是优质的植物基替代蛋白，但相比动物蛋白仍存在钙含量较低的缺陷。本研究测定了不同碱溶酸沉提取工艺、热处理与酶解处理条件下大豆蛋白的钙结合能力，并比较了四种不同制备方式下，大豆蛋白的钙结合能力、亚基组成、二级结构、三级结构以及疏水性的差别，讨论了大豆蛋白钙结合能力与结构的关系。结果表明，大豆蛋白与钙离子的结合与大豆蛋白的二级结构组成和疏水性密切相关。热处理与酶解处理都会使大豆蛋白二级结构展开，疏水性增强，暴露出更多的钙结合位点。但酶解后小分子量蛋白的疏水性聚集，使蛋白空间结构发生改变，对大豆蛋白钙结合能力的改善要优于热处理的效果，结合态钙含量提高了53%。热-酶复合处理大豆蛋白（Heat-enzyme complex treatment of soybean protein，H-SPHs）效果最佳，结合物得率与结合态钙占比均提高了2倍，沉淀率降低了43%，此时大豆蛋白的制备工艺条件为：碱溶pH8、碱溶温度25 ℃、酸沉蛋白与水质量比1:4、中和pH8、100 ℃热处理30 min、1000 U/g风味蛋白酶酶解3 h。Abstract: Soybean protein was a high-quality plant-based alternative protein, yet its calcium content was lower than animal protein. This study measured the calcium-binding ability of soybean protein under different extraction, heat treatment, and enzymatic hydrolysis conditions. The differences in calcium-binding ability, subunit composition, secondary structure, tertiary structure and hydrophobicity of soybean protein under four different preparation methods were compared. The relationship between the calcium-binding ability and the structure of soybean protein were discussed. The results showed that the binding of soybean protein and calcium ions was related to both the protein's secondary structure composition and its hydrophobicity. Heat treatment and enzymatic hydrolysis unfolded the secondary structure, leading to the enhancement of hydrophobicity and the exposure of the calcium-binding sites. Enzymolysis led to the aggregation of small molecular weight proteins, causing a spatial restructuring of the protein. These changes resulted in a 53% increase in bound calcium compared to heat treatment. The heat-enzyme combined treatment was the most effective among various treatments, which could increase the Ca2+ of the protein by about 2 folds and decrease the precipitation rate by 43%. Optimal soybean protein with high calcium-binding ability preparation involved dissolution at pH8 and 25 ℃, with acid-precipitated proteins dissolved in four times water at pH8. Subsequent steps included heating at 100 ℃ for 30 minutes, and enzymatic treatment using 1000 U/g flavor protease for three hours.
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大豆蛋白是一种优质的植物蛋白，具有良好的营养健康属性与功能特性，因而在食品领域应用广泛。近年来，人们营养健康意识与环保意识提升，对植物基食品的兴趣与日俱增[1]。作为植物基食品生产的重要原料，大豆蛋白的应用领域不断拓宽，这也对大豆蛋白的开发与利用提出了更高的要求。大豆蛋白虽具有多种优良特性，但相比于动物蛋白，其钙含量较低，不能满足人们日常对钙摄入的需求[2]。因此，强化大豆蛋白营养，增强其钙结合能力，提高其钙含量是至关重要的。
碱溶酸沉法仍然是国内外提取大豆分离蛋白（soybean protein isolate, SPI）的主要方法之一。SPI提取过程中温度、pH、料液比的变化，以及杀菌闪蒸、喷雾干燥等热处理工序，都会影响所得SPI的构象和性质[3]。其中温度和pH的变化对蛋白质功能性影响较大，通过调整pH可以改善蛋白溶解度，而温度的变化则会对蛋白凝胶性能产生影响[4]。因此，通过调整提取过程中的工艺参数可获得具有不同功能特性的大豆分离蛋白[5]。研究发现，在利用碱溶酸沉法制备大豆蛋白的过程中，用Ca（OH）2部分取代NaOH，在不改变大豆蛋白构象和功能特性的情况下，可得到钙含量6.5 mg/g的大豆蛋白，若不考虑大豆蛋白构效特性的变化，能制得钙含量16.6 mg/g的大豆蛋白[6]。为了得到钙含量更高的大豆蛋白产品，有研究向大豆蛋白中添加分子钙、磷酸三钙等不溶或微溶的钙盐，改善直接添加离子钙导致的大豆蛋白结构和功能特性的变化以及热凝固的问题，达到提高钙含量的目的，但这些钙盐的生物利用度不高[2,7]。也有研究将钙盐进行包埋处理，减少钙与蛋白质的接触，从而避免大豆蛋白发生沉淀，但这需要加入乳化剂、稳定剂等，且多用于豆乳、速溶豆粉体系，不适用于制备大豆蛋白产品[8−9]。因此，更多的研究集中于对大豆蛋白进行糖基化、水热处理、磷酸化、脱酰胺或酶解等改性处理，使其具有更多的钙结合位点，从而进一步提升大豆蛋白产品的钙含量，发现改性后其钙结合能力最高能够达到60 mg/g以上[10]。为得到高钙大豆蛋白，前人采取了调整大豆蛋白提取工艺、改变钙添加形式、改性大豆蛋白等多种手段。在这些方法中，对大豆蛋白进行酶解改性是效果最为显著的，也是近年来的研究热点。由于不同酶的酶切位点不同，所得到的大豆蛋白酶解物（soybean protein hydrolysates，SPHs）钙结合能力也存在差异，其中，风味蛋白酶水解大豆蛋白可得到钙结合量高，苦味弱的酶解产物[8]。目前，大豆肽钙螯合物的制备方法已较为成熟，表征手段也较为完备，然而多在分析前去除不溶性组分，以得到钙含量较高的大豆肽钙螯合物，这损失了很多氨基酸成分，改变了大豆蛋白本身的氨基酸组成，使其在食品工业中生产应用受限。并且关于高钙大豆蛋白的研究多集中于对大豆蛋白进行改性处理，而大豆蛋白提取过程中工艺参数变化对其钙结合能力影响的研究较少。
因此，本文分别探究了大豆分离蛋白提取过程中各条件变化、热处理以及酶解处理对大豆蛋白钙结合能力的影响，并对体系中各形态钙含量进行分析，进一步明确了不同制备方式下大豆蛋白的钙结合能力差异，并且对不同制备方式所得大豆蛋白进行结构表征与功能特性分析，以期阐明其构效关系，为制备具有良好功能特性与稳定性的高钙大豆蛋白提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
脱脂豆粕 山东万得福生物科技有限公司；无水氯化钙（分析纯）、风味蛋白酶（3万U/g） 北京索莱宝科技有限公司。
THZ-82A水浴恒温振荡器 常州荣华仪器制造有限公司；TGL-185M高速离心机 平凡仪器仪表有限公司；LGJ-18A冷冻干燥机 北京四环福瑞科仪有限公司；UVmini-1240紫外可见分光光度计 日本岛津公司；SPECTRUM 100傅里叶变换红外光谱仪 Pkin Elmer公司；CT3物性分析仪 阿美特克-博勒飞公司；DYY-6C电泳仪 北京市六一仪器厂；Model 550酶标仪 美国赛默飞公司。
1.2 实验方法
1.2.1 大豆蛋白-钙结合物制备条件对大豆蛋白钙结合量的影响
1.2.1.1 大豆分离蛋白制备
脱脂豆粕粉碎后按料液比1:15（g/mL）溶于去离子水中，用NaOH溶液调节pH至8，并置于35 ℃水浴锅中搅拌萃取2 h，然后在4000 r/min下离心30 min，收集上清液，加HCl调节pH至4.5并于室温下静置2 h后，于2000 r/min下离心10 min，向离心后沉淀中加入4倍质量的水复溶，用NaOH溶液调节pH至7.5，冷冻干燥得到大豆分离蛋白。
1.2.1.2 蛋白浓度对制得结合物的钙结合量的影响
配制不同浓度的大豆分离蛋白溶液（5%、6%、7%），调pH7.8，按照蛋白与钙比例1:1（g/mmol），加入1 mol/L的CaCl2溶液，于37 ℃振荡1 h，在8000 r/min下离心15 min得到沉淀物，在上清液中加入3倍体积（v/v）无水乙醇，静置30 min后离心得到钙结合物与含游离钙的上清液。
1.2.1.3 大豆蛋白-钙结合物制备pH对钙结合量的影响
配制5%大豆分离蛋白溶液，并分别调pH6.4、7.0、7.8、8.4、9.8，按照蛋白与钙比例1:1（g/mmol），加入1 mol/L的CaCl2溶液，于37 ℃振荡1 h，在8000 r/min下离心15 min得到沉淀物，在上清液中加入3倍体积（v/v）无水乙醇，静置30 min后离心得到钙结合物与含游离钙的上清液。
1.2.2 大豆分离蛋白提取条件对钙结合能力的影响
以脱脂豆粕为原料，采用碱溶酸沉法提取SPI[11]。
1.2.2.1 碱溶pH对大豆蛋白钙结合能力的影响
脱脂豆粕粉碎后按料液比1:15（g/mL）溶于去离子水中，用NaOH溶液分别调节pH至7、8、9，并置于25 ℃水浴锅中搅拌萃取2 h，然后在4000 r/min下离心30 min，收集上清液，加HCl调节pH至4.5并于室温下静置2 h后，于2000 r/min下离心10 min得到酸沉蛋白，按蛋白与水质量比1:4加水复溶，NaOH溶液调节pH至8，冷冻干燥得到不同碱溶pH的大豆蛋白。
1.2.2.2 碱溶温度对大豆蛋白钙结合能力的影响
脱脂豆粕粉碎后按料液比1:15（g/mL）溶于去离子水中，用NaOH溶液调节pH至8，分别置于25、35、45 ℃水浴锅中搅拌萃取2 h，然后在4000 r/min下离心30 min，收集上清液，加HCl调节pH至4.5并于室温下静置2 h后，于2000 r/min下离心10 min得到酸沉蛋白，按蛋白与水质量比1:4加水复溶，NaOH溶液调节pH至8，冷冻干燥得到不同碱溶温度的大豆蛋白。
1.2.2.3 酸沉蛋白与水质量比对大豆蛋白钙结合能力的影响
脱脂豆粕粉碎后按料液比1:15（g/mL）溶于去离子水中，用NaOH溶液调节pH至8，并置于25 ℃水浴锅中搅拌萃取2 h，然后在4000 r/min下离心30 min，收集上清液，加HCl调节pH至4.5并于室温下静置2 h后，于2000 r/min下离心10 min得到酸沉蛋白，分别按蛋白与水质量比1:5、1:4、1:3加水复溶，NaOH溶液调节pH至8，冷冻干燥得到不同蛋白与水比例的大豆蛋白。
1.2.2.4 中和pH对大豆蛋白钙结合能力的影响
脱脂豆粕粉碎后按料液比1:15（g/mL）溶于去离子水中，用NaOH溶液调节pH至8，并置于25 ℃水浴锅中搅拌萃取2 h，然后在4000 r/min下离心30 min，收集上清液，加HCl调节pH至4.5并于室温下静置2 h后，于2000 r/min下离心10 min得到酸沉蛋白，按蛋白与水质量比1:4加水复溶，NaOH溶液调节pH分别至7、8、9，冷冻干燥得到不同中和pH的大豆蛋白。
1.2.3 大豆分离蛋白热处理条件对钙结合能力的影响
脱脂豆粕粉碎后按料液比1:15（g/mL）溶于去离子水中，用NaOH溶液调节pH至8，并置于35 ℃水浴锅中搅拌萃取2 h，然后在4000 r/min下离心30 min，收集上清液，加HCl调节pH至4.5并于室温下静置2 h后，于2000 r/min下离心10 min得到酸沉蛋白。
1.2.3.1 热处理蛋白与水比例对大豆蛋白钙结合能力的影响
将酸沉蛋白加不同比例去离子水（1:5、1:4、1:3）溶解，用NaOH溶液调节pH至8，然后在100 ℃下加热不同时间30 min，之后于冰水浴冷却并冷冻干燥得到不同蛋白与水比例的大豆蛋白。
1.2.3.2 热处理温度对大豆蛋白钙结合能力的影响
向酸沉蛋白中加1:4的去离子水溶解，用NaOH溶液调节pH至8，然后在不同温度（60、80、100 ℃）下加热30 min，之后于冰水浴冷却并冷冻干燥得到不同热处理温度的大豆蛋白。
1.2.3.3 热处理时间对大豆蛋白钙结合能力的影响
向酸沉蛋白中加1:4的去离子水溶解，用NaOH溶液调节pH至8，然后在100 ℃下加热不同时间（15、30、60 min），之后于冰水浴冷却并冷冻干燥得到不同热处理时间的大豆蛋白。
1.2.3.4 大豆分离蛋白酶解处理
将SPI分散于去离子水中，得到5%（w/w）蛋白溶液，调节pH至7.0，并按蛋白底物质量加入1000 U/g风味蛋白酶，在50 ℃搅拌反应一定时间并取样（15、30、60、120、180、240 min），沸水浴灭酶10 min，冰水浴冷却20 min，冷冻干燥得到不同酶解处理的大豆蛋白。
TCA法测水解度：酶解液与20%TCA溶液1:1混合，在4 ℃静置30 min后，12000 r/min离心10 min，取上清。Lowry法测定酶解液与上清液蛋白含量，进而求得水解度（DH）。
DH(%)=酶解后酸溶蛋白总蛋白×100 1.2.4 不同制备方式的大豆蛋白
SPI：脱脂豆粕粉碎后按料液比1:15（g/mL）溶于去离子水中，用NaOH溶液调节pH至8，并置于25 ℃水浴锅中搅拌萃取2 h，然后在4000 r/min下离心30 min，收集上清液，加HCl调节pH至4.5并于室温下静置2 h后，于2000 r/min下离心10 min得到酸沉蛋白，按蛋白与水质量比1:4加水复溶，NaOH溶液调节pH至8，冷冻干燥得到SPI。
SPI-H：将酸沉蛋白加1:4去离子水溶解，用NaOH溶液调节pH至8，然后在100 ℃下加热30 min，之后于冰水浴冷却并冷冻干燥得到SPI-H。
SPHs：将冷冻干燥得到的SPI分散于去离子水中，得到5%（w/w）蛋白溶液，调节pH至7.0，并按蛋白底物质量加入1000 U/g风味蛋白酶，在50 ℃搅拌反应180 min，85 ℃加热15 min灭酶，冰水浴冷却20 min，冷冻干燥得到SPHs。
H-SPHs：向5%（w/w）pH7.0的SPI-H蛋白溶液中加入1000 U/g风味蛋白酶，在50 ℃搅拌反应180 min，之后85 ℃加热15 min灭酶，冰水浴冷却20 min，冷冻干燥得到热-酶复合处理的H-SPHs。
1.2.5 钙结合能力
1.2.5.1 大豆蛋白-钙结合物制备
配制6%蛋白溶液，并调pH8.4，按照蛋白与钙比例1:1（g/mmol），加入1 mol/L的CaCl2溶液，于37 ℃振荡1 h，在8000 r/min下离心15 min得到沉淀物，在上清液中加入3倍体积（v/v）无水乙醇，静置30 min后离心得到钙结合物与含游离钙的上清液。
1.2.5.2 钙结合能力测定
测定干燥后沉淀物质量M1，钙结合物质量M2[12]。蛋白与钙总质量为M0。
沉淀率(%)=M1M0×100 钙结合物得率(%)=M2M0×100 式中：M0为大豆蛋白与添加钙的总质量；M1为离心所得沉淀物质量；M2为钙结合物质量。
EDTA滴定法测定沉淀物、钙结合物与上清中钙含量[13]，占所添加钙含量的百分比即为沉淀中钙、结合态钙与游离态钙占比。
1.2.6 变性蛋白凝胶电泳图谱分析（SDS-PAGE）
用Lowry法测定蛋白浓度，将蛋白样品溶液稀释至2 mg/mL与2×蛋白上样缓冲液1:1混合，沸水浴5 min后离心。按电泳预制胶要求进行电泳，加样10 μL。当彩虹Marker谱带全部显现时，停止电泳。分离电泳胶，摇床振荡染色20 min后，用脱色液漂洗至凝胶底色接近无色。
1.2.7 傅里叶红外光谱（FTIR）
称取2 mg样品与200 mg溴化钾混合后研磨均匀置于模具中，10~12 MPa压制1 min取出，以空白溴化钾为空白对照，于400~4000 cm−1波数下扫描32次。利用OMINC 8.2与PeakFit 4.12软件对采集的数据进行基线校正和数据分析。
1.2.8 内源性荧光光谱分析
将蛋白样品用pH7.2~7.4的PBS缓冲液稀释至0.2 mg/mL。激发波长为290 nm，扫描300~400 nm的荧光光谱。激发和发射狭缝宽均设置10 nm，扫描速度200 nm/min，发射光谱测定3次取平均值。
1.2.9 表面疏水性指数（S0）测定
采用ANS-荧光探针法测定表面疏水性指数（S0）[14]。将蛋白样品用PBS缓冲液稀释至一系列浓度（0.02、0.05、0.125、0.25、0.5 mg/mL），向4 mL蛋白样品中加入40 μL 8 mmol/L ANS溶液，混合均匀后，在暗处反应2 h。采用荧光分光光度计在激发波长390 nm和发射波长470 nm下进行测定，测定三次取平均值。用测得的荧光强度对蛋白浓度做图，经线性拟合后所得斜率即为样品的表面疏水性指数S0。
1.3 数据处理
每个实验重复测量3次，所得数据用SPSS 21软件进行平均值±标准差分析，进行数据显著性分析，P<0.05表示差异显著。用Origin 2018绘图。
2. 结果与分析
2.1 大豆蛋白-钙结合物制备条件对大豆蛋白钙结合能力的影响
大豆蛋白与钙离子的结合受到蛋白浓度、体系pH、反应温度和反应时间等多种因素影响[15]。其中，反应pH是影响钙结合量的重要因素之一，而蛋白浓度不仅影响产物的钙结合量也关乎生产效率。因此，本文主要探究了蛋白浓度与反应pH这两个条件对大豆蛋白-钙结合物制备的影响。
从图1A可以看出，随体系蛋白浓度的升高结合态钙含量明显升高，在蛋白浓度达到7%时达到最高，但其与6%时无显著性差异。这说明蛋白浓度为6%时最利于大豆蛋白与钙结合，并且结合位点达到饱和，蛋白浓度进一步提高，会促进钙诱导大豆蛋白沉淀的发生，也会使过量的蛋白会在醇沉处理时沉淀下来[16]。
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大豆蛋白-钙结合物制备过程中各形态钙占比随反应pH变化如图1B所示，结合态钙占比随pH增高呈现先升高后降低的趋势，在pH为8.4时达到最高值。这是因为碱性条件有利于蛋白与金属离子配合反应的进行，但碱性环境中，金属离子也会生成氢氧化物沉淀，不利于配合反应的发生，这也就导致了沉淀中钙含量随反应pH升高而呈现一直升高的趋势[13,16]。
根据以上结果确定本文中大豆蛋白-钙结合物制备的蛋白溶液浓度为6%（w/v），反应pH为8.4。
2.2 大豆蛋白制备过程中各条件变化对其钙结合能力的影响
2.2.1 大豆分离蛋白提取条件对其钙结合能力的影响
碱溶酸沉法仍然是国内外提取大豆分离蛋白的主要方法之一[5]。在碱溶酸沉提取蛋白过程中碱溶pH、碱溶温度、酸沉蛋白与水质量比和中和pH是影响蛋白提取率、结构和功能的重要因素。因此，本文分别制备了不同碱溶pH、不同碱溶温度、不同酸沉蛋白与水质量比和不同中和pH的SPI，并将其配制成6%（w/v）蛋白溶液，在pH8.4与CaCl2进行反应，测定反应后体系中各形态钙占比。
蛋白质结构对环境变化具有很强的敏感性，SPI在不同pH下的结构形态不同，功能特性也会存在差异[17]。从图2中可以看出随碱溶pH与中和pH的提高，反应后体系中结合态钙占比呈现先升高后降低的趋势，并且同在pH为8时具有最强的钙结合能力。这可能是因为SPI在偏碱性条件下具有更高的溶解度，蛋白结构舒展，暴露出更多钙结合位点；但当pH超过9时则会引起“胱赖反应”，导致脱氨、脱羧、肽键断裂，而这些恰是主要的钙结合位点[18]。
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图 2 碱溶pH（A）、碱溶温度（B）、酸沉蛋白与水质量比（C）、中和pH（D）对大豆蛋白钙结合能力的影响Figure 2. Effects of alkali-soluble pH (A), alkali-soluble temperature (B), mass ratio of acid precipitate protein to water (C), neutralization pH (D) on calcium-binding capacity of soy protein碱溶温度的变化也会影响SPI的结构与功能。随碱溶温度的提高，体系中结合态钙占比逐渐下降，说明碱溶温度的升高使SPI结构逐渐展开，埋在蛋白内部的巯基暴露出来，蛋白疏水性增强，可溶蛋白逐渐转变为不溶性蛋白，导致可溶组分的钙结合位点减少，结合态钙占比逐渐下降[19]。结构展开的不溶性蛋白由于暴露出更多的巯基，而更易结合钙离子，使得沉淀中钙占比增多[20]。碱溶温度升高至45 ℃时，蛋白结构进一步展开，易在钙离子作用下聚集沉淀，从而无法结合更多的钙离子，导致沉淀中钙占比减少[2]。
大豆分离蛋白的钙结合能力与酸沉蛋白与水质量比也有一定关系。不同蛋白浓度下的大豆蛋白具有不同的体系性状，钙结合能力也存在显著差异[21]。酸沉蛋白与水质量比1:3所制的SPI钙结合能力显著（P<0.05）高于酸沉蛋白与水质量比1:4与1:5所制SPI。这可能是因为大豆蛋白浓度较高时，大豆蛋白结构没有完全展开，与水分子之间相互作用较弱，所形成的空间结构更利于与钙离子结合。
2.2.2 大豆蛋白热处理条件对其钙结合能力的影响
由图3可知，随加热时蛋白浓度的升高，所得SPI与Ca2+反应体系中结合态钙占比呈现先增多后减少的趋势，由此看来加热过程中过高或过低的蛋白浓度都不利于SPI钙结合位点的暴露。在较低蛋白浓度下，SPI经热处理结构展开充分，暴露出过多的疏水性氨基酸残基，易形成聚集体；而在过高的蛋白浓度下，由于空间位阻作用，SPI展开不够充分[22]。
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图 3 蛋白与水质量比（A）、加热温度（B）、加热时间（C）对大豆蛋白钙结合能力的影响Figure 3. Effects of mass ratio of protein to water (A), heating temperature (B), heating time (C) on calcium-binding capacity of soy protein随加热温度的升高，反应体系中结合态钙占比呈现先减少后增多的趋势，在80 ℃时的钙结合能力最弱。这主要是因为大豆分离蛋白中的大豆球蛋白（11S球蛋白）和伴大豆球蛋白（7S球蛋白）这两种主要成分的变性温度不同，7S的变性温度为72 ℃，而11S的变性温度为90 ℃[23]。80 ℃是大豆蛋白变性的临界温度，在80 ℃以下蛋白质变性程度非常低，经80 ℃加热处理后，SPI中7S球蛋白变性形成聚集体，11S还未变性，蛋白亚基含量急剧下降，导致此时的钙结合位点减少；而经100 ℃加热处理后，11S球蛋白发生解离缔合行为，从而暴露出更多钙结合位点[24−25]。
随加热时间的延长，反应体系中结合态钙占比呈现先增多后减少的趋势。这是因为热处理会导致SPI的结构更加舒展，暴露出更多钙结合位点；但过度的热处理又会使蛋白之间产生过度的疏水相互作用，从而形成聚集体，导致暴露出的钙结合位点被包裹在内部[26]。
确定热处理的SPI的制备条件为：碱溶pH8、碱溶温度25 ℃、中和蛋白浓度1:4、中和pH8、加热温度100 ℃、加热30 min。
2.2.3 大豆蛋白酶解处理条件对其钙结合能力的影响
越来越多的研究表明，酶解可改善大豆蛋白的功能性，提高其与钙离子的结合能力，形成可溶性钙结合物，促进钙的吸收利用[8]。水解度是影响大豆分离蛋白水解产物钙结合量的重要因素。由图4可知，随着水解时间的延长，大豆蛋白水解度不断提高，钙结合能力呈现先升高后降低的趋势，在1000 U/g风味蛋白酶酶解180 min时的SPHs具有最强的钙结合能力。SPHs的钙螯合能力与其分子量、氨基酸组成、氨基酸序列和空间构象密切相关[27−28]。SPHs和Ca2+的相互作用主要发生在羧基氧原子和氨基氮原子上，且带负电荷的酸性氨基酸Asp和Glu更易与金属离子形成共价键[29−31]。即含有更多酸性氨基酸的低分子量肽具有更强的钙结合能力[32]。因此SPHs水解度越高，越能暴露出更多羧基、氨基等钙结合位点，钙结合能力越强。但水解过度会导致活性片段降解，使得具有金属结合能力的裂解位点数量减少[33]。
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图 4 酶解时间对大豆蛋白水解度（A）与钙结合能力（B）的影响Figure 4. Effects of enzymatic hydrolysis time on the degree of hydrolysis (A) and calcium-binding capacity (B) of soy protein确定酶解处理的SPI的制备条件为：碱溶pH8、碱溶温度25 ℃、中和蛋白浓度1:4、中和pH8、1000 U/g风味蛋白酶酶解180 min。
2.2.4 不同制备方式大豆蛋白钙结合能力差异
虽然SPI提取时，在蛋白与水比例1:3的条件下所制备的SPI的钙结合能力最强，但是考虑到后续热处理的最适比例为1:4，为保证不同制备方式之间所用提取条件的一致性，确定SPI提取条件为：碱溶pH8、碱溶温度25 ℃、酸沉蛋白与水质量比1:4与中和pH8。
选择最佳的热处理条件和酶解条件对经提取优化制备的SPI进行不同的处理，得到提取优化的SPI（SPI）、热处理的SPI（SPI-H）、酶解处理的SPI（SPHs）以及热-酶复合处理的SPI（H-SPHs）这四种不同制备方式的大豆蛋白，对其钙结合能力进行分析见图5，发现热处理与酶解处理都会显著提高钙结合物得率与结合态钙占比（P<0.05），改善大豆蛋白的钙结合能力，酶解处理较热处理效果更加明显，且热-酶复合处理明显改善了大豆蛋白遇钙沉淀的现象，显著降低了加钙反应后蛋白沉淀率（P<0.05），钙结合物得率最高且结合态钙占比达到20%，说明其钙结合能力最强。
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图 5 不同制备条件对大豆蛋白沉淀率（A）、结合物得率（B）、钙结合能力（C）的影响Figure 5. Effects of different preparation conditions on precipitation rate (A), yield of conjugate (B), calcium-binding capacity (C) of soy protein热-酶复合处理的SPI（H-SPHs）具有最佳钙结合能力，其制备条件为：碱溶pH8、碱溶温度25 ℃、中和料液比1:4、中和pH8、100 ℃热处理30 min、1000 U/g风味蛋白酶酶解3 h。
2.3 不同制备方法对大豆蛋白结构的影响
2.3.1 不同制备方式对大豆蛋白亚基组成的影响
从图6可以看出，酶解会使高分子量蛋白亚基解离为更小分子量肽段，从而使蛋白整体分子量变低，且H-SPHs的酶解程度明显高于SPHs，小分子量蛋白更多，因此，其钙结合能力也更强。SPHs的7S组分中α与α'亚基基本酶解彻底，但仍保留部分7S组分的β亚基与11S组分，而H-SPHs的7S与11S组分都酶解较为彻底。这是因为热处理使结构紧密的SPI的结构打开，从而使包埋在分子内部的酶结合位点释放出来，提高了后续酶解的效率[26]。
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图 6 不同制备条件大豆蛋白的SDS-PAGE电泳谱图Figure 6. SDS-PAGE of soybean protein under different preparation conditions2.3.2 不同制备方式对大豆蛋白二级结构的影响
使用Omnic 8.2软件和PeakFit 4.12软件对傅里叶红外光谱中1600~1700 cm−1的二级结构变化进行分析，计算各二级结构的比率[26]，结果见图7。从拟合后数据可以看出，与SPI相比，热处理与酶解处理均会导致α-螺旋和β-折叠含量减少，β-转角和无规则卷曲含量增多，可见蛋白质的二级结构受到影响，使得总体上有序结构减少，无序结构增加，蛋白分子展开，空间结构发生改变[25]。酶解程度更高的H-SPHs的有序结构较SPHs却有所提高，可能是因为在大豆蛋白酶解过程中，产生了大豆肽不溶性聚集体，且酶解程度越高越易产生[34]。
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图 7 不同制备条件大豆蛋白的红外谱图（A）与二级结构占比（B）Figure 7. FTIR (A) and secondary structure content (B) of soybean protein under different preparation conditions2.3.3 不同制备方式对大豆蛋白三级结构的影响
为探究不同制备方式对大豆蛋白三级结构的影响，测定四种制备方式所得大豆蛋白的内源性荧光光谱与疏水性。由图8可知，大豆蛋白荧光吸收主要来自蛋白内色氨酸残基，热处理与酶解处理后λmax均大于330 nm，荧光光谱峰值发生了红移，热处理与酶解处理改变蛋白质三级结构及构象，蛋白结构展开，使埋藏在内部的色氨酸残基暴露于蛋白质外部环境，疏水性显著增强（P<0.05）[25]。酶解与热处理也导致了荧光光谱峰值降低，使得处理后的大豆蛋白产生了明显的荧光淬灭，这也说明了在所用的酶解与热处理条件下，大豆蛋白发生变性，结构更加舒展，疏水性基团充分暴露出来，与此同时，蛋白之间产生的过度疏水相互作用导致肽段部分聚集，进而使SPI发生荧光淬灭[17]。H-SPHs的酶解程度更高，疏水性氨基酸残基暴露更多，红移更明显，但其荧光淬灭也更加明显，同时疏水性较低，说明其发生了更强烈的蛋白聚集现象，导致蛋白重新组合成新的有序结构，这与红外拟合的结果相一致。SPI-H的红移程度虽强于SPHs，但其荧光淬灭程度却最低，说明热处理导致的疏水性增强与酶解不同，分子量大的蛋白不易再因疏水相互作用而聚集。
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图 8 不同制备条件大豆蛋白的内源性荧光光谱Figure 8. Endogenous fluorescence spectra of soybean protein under different preparation conditionsSPHs的聚集对其钙结合能力有重要作用，而疏水相互作用是其主要驱动力。有研究发现，疏水性氨基酸与钙结合氨基酸位于蛋白分子两侧，当两个蛋白分子通过疏水相互作用聚集在一起形成新的蛋白分子时，会使钙结合氨基酸集中在分子表面，形成比非聚集肽更有利于钙结合的“钙结合区”，从而提高钙的结合能力[35]。因此，H-SPHs虽然酶解程度高、钙结合能力强，但无序结构含量不高、疏水性较低（见图9）。
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图 9 不同制备条件大豆蛋白的疏水性S0Figure 9. Hydrophobicity S0 of soybean protein under different preparation conditions3. 结论
本文探讨了大豆蛋白钙结合能力的影响因素，并阐明了不同制备条件下大豆蛋白结构和钙结合能力的关系，为制备高钙大豆蛋白提供理论依据。通过单因素（蛋白浓度、反应pH）实验确定了结合物制备的最佳条件为：蛋白溶液浓度6%（w/v）、反应pH8.4。在此条件下，进一步探究碱溶酸沉的提取过程、热处理与酶解处理对大豆蛋白钙结合能力与结构的影响。结果表明，酶解处理对大豆蛋白的钙结合能力的提高要优于热处理，且热-酶复合处理效果最佳。最优的制备工艺条件为：碱溶pH8、碱溶温度25 ℃、酸沉蛋白与水质量比1:4、中和pH8，100 ℃热处理30 min，1000 U/g风味蛋白酶酶解3 h，在此条件下，结合态钙含量达到了20%，钙结合能力相较于SPI提升了2倍。大豆蛋白的钙结合能力主要取决于其二级结构与疏水性，无序的二级结构与疏水性基团的暴露利于钙离子的结合与酶解的进行。同时，疏水基团的充分暴露增强了蛋白间疏水相互作用，导致低分子量蛋白聚集，而改变其空间结构，从而提高钙结合能力。
本研究为高钙大豆蛋白产品的开发提供了理论依据，后续仍需进一步研究钙结合物的功能特性与稳定性，以期得到应用于不同食品基质的高钙大豆蛋白。
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图 2 碱溶pH（A）、碱溶温度（B）、酸沉蛋白与水质量比（C）、中和pH（D）对大豆蛋白钙结合能力的影响
Figure 2. Effects of alkali-soluble pH (A), alkali-soluble temperature (B), mass ratio of acid precipitate protein to water (C), neutralization pH (D) on calcium-binding capacity of soy protein
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图 3 蛋白与水质量比（A）、加热温度（B）、加热时间（C）对大豆蛋白钙结合能力的影响
Figure 3. Effects of mass ratio of protein to water (A), heating temperature (B), heating time (C) on calcium-binding capacity of soy protein
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图 4 酶解时间对大豆蛋白水解度（A）与钙结合能力（B）的影响
Figure 4. Effects of enzymatic hydrolysis time on the degree of hydrolysis (A) and calcium-binding capacity (B) of soy protein
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图 5 不同制备条件对大豆蛋白沉淀率（A）、结合物得率（B）、钙结合能力（C）的影响
Figure 5. Effects of different preparation conditions on precipitation rate (A), yield of conjugate (B), calcium-binding capacity (C) of soy protein
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图 6 不同制备条件大豆蛋白的SDS-PAGE电泳谱图
Figure 6. SDS-PAGE of soybean protein under different preparation conditions
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图 7 不同制备条件大豆蛋白的红外谱图（A）与二级结构占比（B）
Figure 7. FTIR (A) and secondary structure content (B) of soybean protein under different preparation conditions
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图 8 不同制备条件大豆蛋白的内源性荧光光谱
Figure 8. Endogenous fluorescence spectra of soybean protein under different preparation conditions
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