Effects of Cerasus humilis Composite Rod on Anti-fatigue Capacity and Energy Metabolism in Mice
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摘要: 目的:探讨欧李复合棒对小鼠抗疲劳能力及能量代谢的影响。方法:选择8周龄健康雄性小鼠50只随机分为5组:空白组、模型组、欧李复合棒组、阳性组、高脂组。通过建立游泳+控制饮食的疲劳模型,连续喂养21 d后,进行爬杆和力竭游泳时间实验,检测小鼠疲劳、能量代谢及抗氧化相关指标。结果:与空白组比较,模型组小鼠的爬杆时间、游泳时间极显著下降(P<0.01),乳酸、尿素氮、肌酸激酶、丙二醛的含量极显著增高(P<0.01),血清超氧化物歧化酶、肝脏Na+-K+-ATP酶、Ga2+-Mg2+-ATP酶显著下降(P<0.05);与模型组比较,复合棒组和阳性组可以显著延长小鼠爬杆时间和游泳至力竭的时间,分别是模型组的2.1、1.8倍,可有效减少能量消耗,减少乳酸、尿素氮的积累(P<0.01,P<0.05),极显著降低血清中丙二醛、肌酸激酶的含量,增强小鼠血清SOD酶活力(P<0.01),提高肝脏中Na+-K+-ATP酶、Ga2+-Mg2+-ATP酶活性(P<0.01),提高ATP含量水平,发挥抗疲劳活性。结论:复合棒具有显著的抗疲劳能力和能量代谢能力,通过提高小鼠爬杆时间和负重力竭游泳时间改善小鼠运动能力水平,通过降低能量消耗,增加能量代谢,提高运动耐力,提高抗氧化能力,进而缓解疲劳。Abstract: Objective: To investigate the effects of Cerasus humilis composite rod on fatigue resistance and energy metabolism in mice. Methods: Fifty healthy male mice at 8 weeks of age were randomly divided into 5 groups: Control group, model group, Cerasus humilis composite rod group, positive group and high-fat group. By establishing a fatigue model of swimming+diet control, after 21 days of continuous feeding, the fatigue, energy metabolism and antioxidant related indexes of mice were detected by climbing poles and exhausting swimming time. Results: Compared with the control group, the climbing time and swimming time of the model group decreased significantly (P<0.01), the contents of lactate, blood urea nitrogen, creatine kinase and malondialdehyde were significantly increased (P<0.01), and serum superoxide dismutase, hepatic Na+-K+-ATPase and Ga2+-Mg2+-ATPase decreased significantly (P<0.05). Compared with the model group, the Cerasus humilis composite rod group and positive group could significantly prolong the time of climbing the pole and the time of swimming to exhaustion, which were 2.1 and 1.8 times that of the model group, and could effectively reduce energy consumption, reduce the accumulation of lactate and blood urea nitrogen (P<0.01, P<0.05), reduce the content of MDA and CK in serum, enhance the activity of SOD enzyme in serum (P<0.01), increase the activities of Na+-K+-ATPase and Ga2+-Mg2+-ATPase in liver (P<0.01), increase the level of ATP content and exert anti-fatigue activity. Conclusion: The composite rod has significant anti-fatigue ability and energy metabolism ability, which can improve the exercise ability level of mice by increasing the pole climbing time and weight-bearing exhaustion swimming time, and alleviate fatigue by reducing energy consumption, increasing energy metabolism, improving exercise endurance and improving antioxidant capacity.
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Keywords:
- Cerasus humilis /
- composite rod /
- anti-fatigue /
- energy metabolism
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随着社会生活水平的提高,社会竞争愈加激烈,高强度、大负荷的工作节奏使疲劳成为当代社会的一个突出问题。长期疲劳会导致记忆力下降、睡眠障碍,严重影响人们的工作效率和生活质量,如果久久不可恢复,会发展为慢性疲劳综合征,更严重会引发心血管疾病,危害健康。有研究表明,关于疲劳的发生机制主要是能量代谢失衡、代谢产物堆积、内环境失衡、神经递质异常等[1]。近年来,越来越多的人们认识到缓解疲劳对健康的重要性,缓解疲劳的药物和产品也受到越来越多的关注。因此,研发具有抗疲劳效果的药物和保健品对缓解疲劳、提高生活质量具有重要意义。
复合棒由核桃仁、欧李果脯、红枣提取物、花生仁等构成,是一种方便携带、营养丰富的休闲食品。欧李,又称“钙果”,果实风味酸甜、香气浓郁、颜色诱人、营养丰富[2−3],欧李中不仅含有蛋白质[4]、氨基酸、维生素[5],还含有的大量多酚物质[6],既可即食,经加工制作蜜饯、低糖果脯、果汁饮料等产品,也可以经处理得到不同提取物。王瑶等[7]对小鼠灌胃欧李山楂沙棘复合饮料20 d后,发现欧李山楂饮料可显著延长小鼠负重游泳时间,增加肝糖原含量、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽酶(GSH)的活性,降低血乳酸、尿素氮及丙二醛含量,具有一定抗疲劳作用。核桃含有蛋白质[8]、氨基酸、酚类及黄酮化合物等物质,其中蛋白质含量约14%~17%,包含8种人体必需氨基酸。核桃仁油脂含量60%~70%,且以不饱和脂肪酸为主(如亚油酸、亚麻酸[9]),具有降胆固醇、降血糖[10]、抗炎、预防癌症、降低心血管疾病的作用[11−12]。红枣中含有氨基酸、蛋白质、多糖、环磷酸腺苷等物质,其中环磷酸腺苷在众多天然植物中含量最高[13],达到100~500 nmol/g,具有消除机体自由基、延缓细胞衰老、预防心脑血管疾病、抗肿瘤等作用[14−16]。董立军等[17]对40只雄性小鼠灌胃不同剂量红枣浓缩汁,发现中剂量组的红枣浓缩汁可以极显著延长小鼠的力竭时间,增强小鼠体内肝糖原和肌糖原的储备,显著提高小鼠吞噬指数和抗体生成细胞数,缓解小鼠的疲劳现象、增强小鼠的免疫功能。
从上述研究可知,欧李、红枣具有较好的抗疲劳活性,但目前将二者结合的相关食品开发却少之又少,为此本研究以其为主要原料制备复合棒,通过构建小鼠疲劳动物模型,检测小鼠爬杆时间和负重游泳时间,评价复合棒改善小鼠运动能力的水平,随后检测疲劳相关指标、能量代谢相关指标、抗氧化相关指标,系统评价抗疲劳及能量代谢的影响,为药食同源产品开发及其提高运动表现提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
SPF级雄性小鼠 8周龄,体重20~26 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2021-0009;核桃仁 山西林业与草原学院;欧李 山西农业大学提供;乳酸、肌酸激酶、丙二醛、超氧化物歧化酶测试盒、考马斯亮蓝试剂盒、Na+-K+-ATP酶试剂盒、Ca2+-Mg2+-ATP酶试剂盒、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血糖(GLU) 南京建成生物工程研究所。
101型电热鼓风干燥箱 北京市永光明医疗仪器有限公司;B-260恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂;HC-3018R高速离心机 北京思博晟达科技有限公司;MY-20迷你手持匀浆机 杭州米欧仪器有限公司;BIOBASE-EL10自动酶标仪 济南济威医疗器械有限公司;T2600紫外可见分光光度计 上海佑科仪器表有限公司;Adventurer分析电子天平 美国奥豪斯仪器有限公司;XK96-A快速混匀器 江苏新康医疗器械有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 复合棒制备
原辅料预处理:将新鲜、质量较好的欧李,清洗,切半去核,加入白砂糖,搅拌,糖煮15 min,将糖煮后的欧李果放在该糖液中渗透一定时间后,放入烘箱60 ℃烘干2 h,确保烤盘每个位置均匀受热,留存备用。依据文献[18]将饱满、质量较优红枣,清洗去核,干燥粉碎过80目筛,以料液比1:10,于100 ℃水浴中回流提取1 h,3000 r/min,离心5 min过滤,取上清液,再向枣渣加入100 mL蒸馏水,重复提取2次。合并3次提取上清液浓缩至50 mL,所得浓缩液即为红枣样品溶液,置于4 ℃冰箱备用。选取颗粒饱满、无腐烂虫蛀的核桃,去壳,于烤箱170 ℃烘烤6 min增香上色;另准备花生仁备用。
混合成型:将处理后的核桃仁40%、红枣提取物4%、欧李果脯15%、花生仁10%等原辅料混合均匀,放入模具中,将其紧实挤压成型。
烘烤:将成型的复合棒放入干燥箱烘烤,烘烤温度为170 ℃,烘烤时间为20 min。
冷却与包装:将烘烤好的复合棒冷却成型后及时切条包装。
1.2.2 动物分组及模型建立
将50只8周龄雄性小鼠在室温为(22±2)℃的动物房适应性饲养3 d后随机分为5组,每组10只,分别为空白组、疲劳模型组、欧李复合棒组、阳性组、高脂组。除空白组,其他各组进行控制饮食+游泳的方法进行造模。空白组:常规基础饲料和自由饮水,无爬杆和游泳实验;疲劳模型组:基础饲料(每日按75 g/kg提供饲料)和自由饮水;复合棒组:复合棒(每日按75 g/kg提供);阳性组:市面销售的某坚果复合棒(花生仁、巴旦木、蔓越莓脯、白砂糖等,每日按75 g/kg提供)。高脂组:自制高脂饲料(基础饲料75%、猪油15%、蔗糖8%、食盐2%,每日按75 g/kg提供)每天喂养1次,连续喂养21 d后,进行爬杆、负重游泳实验。游泳运动后,将各组小鼠捞出吹干,摘眼球取血,脱颈处死,测定疲劳及能量代谢等生化指标。本实验涉及所有实验动物饲养均符合国家实验动物福利指南及实验动物伦理规范。
疲劳模型建立:除空白组,其余4组每天进行游泳试验,第1 d开始游40 min,之后每天增加15 min。直到小鼠开始下沉,立即捞出。
1.2.3 小鼠体重及脏器指数测定
每周进行称重并记录数据,21 d后脱颈处死,取心、肝、脾、脑进行称重并记录数据。脏器指数公式:
1.2.4 小鼠血糖及血脂指标测定
小鼠喂养21 d后,摘眼球取血,按照说明书要求测定TG、HDL和血糖GLU的含量。
1.2.5 爬杆实验
参考文献[19],小鼠喂养21 d后1 h,将小鼠放在一条长约30 cm,直径约0.6 cm的光滑铁杆的上端,开始计时,当小鼠肌肉疲劳掉下来,停止计时,记录3次滑落时间之和作为爬杆时间。
1.2.6 负重游泳实验
小鼠喂养2 h后,在每只小鼠尾部负重5%体质量的夹子进行负重游泳实验。试验环境游泳箱(水深约30 cm,水温约25±1 ℃),将小鼠放入水中开始计时,若小鼠漂浮于水面,用木棒搅动水,使小鼠保持游泳运动状态,记录小鼠沉入水底内不再上浮的时间。
1.2.7 疲劳及抗氧化指标测定
在游泳实验结束30 min后脱颈处死,眼球取血,静置2 h左右,3000 r/min离心10 min,取血清。依据相应试剂盒,检测小鼠血清中乳酸、尿素氮、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。
1.2.8 肝脏组织能量代谢的测定
小鼠眼球取血后,迅速取出肝脏,生理盐水清洗后,滤纸吸干,称重,迅速放入−80 ℃冻存备用。分别称取0.1 g组织,用生理盐水清洗干净,滤纸吸干,剪碎,加入0.9 mL生理盐水匀浆,3000 r/min离心10 min,取上清液,根据试剂盒检测Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶吸光度。
1.3 数据处理
采用SPSS 26.0软件进行统计学处理,采用单因素方差分析,结果以“平均值±标准差”表示,实验数据平行测定3次,采用GraphPad Prism8软件进行作图,以P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 复合棒对小鼠体重及脏器指数的影响
由表1可知,试验期间,所有动物状态良好,未出现死亡情况。各组小鼠间均未出现异常情况,饮食饮水正常。小鼠的体重增长情况及脏器指数反应了小鼠的机体健康状态,各组小鼠体重及脏器指数变化见表2。由表1可得出,在给药0、7、14、21 d,各组小鼠体重均呈增长趋势,但各组之间无显著性差异。在0、7、14、21 d,小鼠体重增长,与空白组相比均无显著性差异(P>0.05),各脏量及脏器指数与空白组相比无显著性差异(P>0.05),表明喂养的复合棒、阳性药、高脂饲料对小鼠机体均无毒副作用。
表 1 复合棒对小鼠体重的影响(g,x±s,n=10)Table 1. Effect of composite rods on body weight in mice(g, x±s, n=10)组别 0 d 7 d 14 d 21 d 空白组 21.50±1.50 33.3±3.09 38.50+3.99 38.67±4.03 模型组 22.17±3.02 24.83±3.29 27.67+3.35 27.00±2.89 复合棒组 20.33±1.70 25.17±1.86 28.17+2.27 28.67±1.60 阳性组 23.00±1.63 24.83±1.34 26.33+1.89 26.67±1.49 高脂组 25.17±1.34 28.50±1.12 31.67+1.80 32.67±1.49 注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01,无标注,表明不存在显著性差异(P>0.05),表2同。 表 2 复合棒对小鼠脏器指数的影响(g,x±s,n=10)Table 2. Effect of composite rod on organ index in mice(g, x±s, n=10)分组 心脏器指数 肝脏器指数 脾脏器指数 脑脏器指数 空白组 0.67±0.07 5.57±2.32 0.44±0.07 1.37±0.12 模型组 0.46±0.06 5.06±0.38 0.23±0.05 1.24±0.18 复合棒组 0.41±0.09 4.41±0.84 0.20±0.02 1.26±0.53 阳性组 0.42±0.05 4.18±0.74 0.19±0.03 1.18±0.06 高脂组 0.50±0.08 4.96±0.44 0.28±0.04 1.02±0.08 2.2 复合棒对小鼠血糖、血脂影响
血清中所有的脂类物质合称为血脂,其中总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白是衡量血脂水平的重要指标[20]。由表3可以看出,与空白组相比,模型组小鼠血液血糖、甘油三酯含量显著降低(P<0.05);与模型组相比,复合棒组可显著(P<0.05)升高GLU和HDL水平,降低TG水平。可能是由于复合棒中含有不饱和脂肪酸(亚油酸、油酸等)会加快血液中胆固醇的代谢,增加HDL的浓度。高脂组小鼠的甘油三酯(TG)比较高,可能是饲料中含有猪油。说明复合棒在一定程度上能降低机体体内血脂浓度,维持机体健康水平。
表 3 复合棒对小鼠血糖、血脂的影响(g,x±s,n=10)Table 3. Effect of composite rod on blood glucose and blood lipids in mice (g, x±s, n=10)组别 GLU(mmol/L) TG(mmol/L) HDL(mmol/L) 空白组 6±1.41 1.28±0.54 1.09±0.17 模型组 3.55±0.65* 0.88±0.21* 0.94±0.11 复合棒组 4.42±0.86# 0.62±0.29# 1.26±0.13# 阳性组 4.98±1.47 0.78±0.22 1.23±0.16 高脂组 5.58±0.65# 1.05±0.18 1.22±0.16 注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。 2.3 复合棒对小鼠爬杆时间的影响
爬杆实验考察小鼠肌肉对静态力的持久能力,爬杆时间的越长,小鼠的肌肉持久力越长,耐疲劳程度越强。由图1可以看出,与空白组比较,模型组小鼠的爬杆时间极显著下降(P<0.01)。与模型组相比,复合棒组、阳性组能显著延长小鼠爬杆时间(P<0.01,P<0.05),高脂组小鼠爬杆时间不显著(P>0.05)。
2.4 复合棒对小鼠负重游泳时间的影响
机体在大量运动后,体内糖原被快速消耗,导致血糖水平降低,能量输出减少。负重游泳可以很直观地反应运动疲劳状态[21−22],是目前常见的抗疲劳运动实验的模型,用来考察小鼠运动耐力,小鼠在水中游的时间越长,运动耐力越强,力竭时间用来代表小鼠疲劳程度[23]。由图2可以看出,与空白组比较,模型组小鼠的负重游泳时间极显著下降(P<0.01);与疲劳模型组相比,复合棒组、阳性组能极显著延长小鼠的负重游泳时间(P<0.01),分别是模型组的2.1、1.8倍,表明复合棒组、阳性组能显著增强小鼠的抗疲劳能力。
2.5 复合棒对小鼠血清的乳酸、尿素氮的影响
在剧烈运动后,机体产生大量代谢产物乳酸,导致运动能力下降引起疲劳。血清中乳酸含量是准确反应机体疲劳程度的重要生化指标[24−25]。尿素氮是氨基酸与蛋白质代谢的重要产物,大量运动导致蛋白质和氨基酸分解代谢增加,尿素氮增强[17],过量的尿素在体内积累会造成伤害,引起疲劳。由图3可知,与空白组相比,模型组小鼠游泳后的乳酸、尿素氮的含量极显著增高(P<0.01);与模型组相比,复合棒组、阳性组和高脂组血清乳酸、尿素氮显著降低(P<0.01,P<0.05),结果表明,复合棒组可以降低机体中乳酸、尿素氮含量,提高血乳酸代谢能力,有效提高机体的抗疲劳能力,从而起到缓解疲劳作用。
2.6 复合棒对小鼠血清肌酸激酶的影响
肌酸激酶是一种重要激酶,参与细胞能量转移,促进能量代谢。肌酸激酶升高可以增加能量代谢、产生较多乳酸,影响运动能力。血液中的肌酸激酶活性是检验肌肉损伤的重要指标[26]。由图4可以看出,与空白组比较,疲劳模型组小鼠在游泳后肌酸激酶极显著增高(P<0.01)。与模型组相比,复合棒组血清肌酸激酶极显著降低(P<0.01),阳性组和高脂组的血清肌酸激酶显著降低(P<0.05)。结果表明,复合棒组可以降低机体中肌酸激酶活性,降低代谢产物的积累,从而起到缓解疲劳作用。
2.7 复合棒对小鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛的影响
丙二醛是脂质过氧化的最终产物及重要指标,丙二醛的含量可以反应机体受脂质氧化损伤的程度[27−28]。超氧化物歧化酶是生物体内重要的抗氧化酶,维持机体内氧自由基的动态平衡[29],当机体中有大量的超氧化物歧化酶时,可以有效清除在运动中产生的自由基,通过抵消氧化应激缓解疲劳[30]。因此,超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量可以评价小鼠的抗疲劳能力。由图5可知,与空白组比较,模型组小鼠血清中超氧化物歧化酶活力显著降低,疲劳模型成立,丙二醛活性升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,复合棒组、阳性组小鼠超氧化物歧化酶活性极显著升高(P<0.01),高脂组无显著性差异(P>0.05);丙二醛活性均极显著降低(P<0.01)。上述结果表明,复合棒可有效提高小鼠血清超氧化物歧化酶活力,进而增强机体的防御机制,降低脂质过氧化水平,起到抗疲劳的作用[24]。
2.8 复合棒对小鼠肝脏组织Na+-K+-ATPase、Ga2+-Mg2+-ATPase的影响
疲劳发生的主要原因是能源物质如高能磷酸物、糖原的大量消耗,在运动时需要消耗大量的ATP,而Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶是ATP水解过程中的主要酶,疲劳状态下线粒体受损,其活性较低[31]。线粒体是细胞有氧代谢的重要产所[32],氧化磷酸化是提供能量的来源。当机体处于疲劳状态下,线粒体氧化代谢能力将会下降。研究表明,在剧烈运动后,细胞内ATP含量下降,合成效率下降[33]。由图6可以看出,与空白组比较,模型组小鼠的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力极显著降低(P<0.01)。与模型组相比,复合棒组、阳性组和高脂组的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力显著升高(P<0.01,P<0.05),表明复合棒可以通过增强能量代谢水平,维持细胞内外稳定,增强运动时线粒体整体功能,维持肝脏正常活动、延缓疲劳。
3. 结论
随着现代社会发展,工作压力增大、生活节奏加快,使得人们更容易出现疲劳。本研究通过建立游泳+控制饮食的疲劳模型,研究复合棒对小鼠抗疲劳作用及能量代谢的影响。实验结果表明,与疲劳模型组比较,复合棒组可以显著延长小鼠爬杆时间和游泳至力竭的时间,可有效减少能量消耗,加快乳酸清除,减少尿素氮的积累,缓解疲劳状态,降低血清中丙二醛、肌酸激酶的含量,增强小鼠超氧化物歧化酶活力,提高肝脏中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平活性,减缓疲劳小鼠能量代谢速率,降低能量消耗,维持细胞正常功能,延长供能时间,提高运动耐力,增强小鼠的抗疲劳作用。综上,说明复合棒对小鼠具有显著的抗疲劳作用,该研究为药食同源中药的合理应用及相关产品开发提供实验依据。
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表 1 复合棒对小鼠体重的影响(g,x±s,n=10)
Table 1 Effect of composite rods on body weight in mice(g, x±s, n=10)
组别 0 d 7 d 14 d 21 d 空白组 21.50±1.50 33.3±3.09 38.50+3.99 38.67±4.03 模型组 22.17±3.02 24.83±3.29 27.67+3.35 27.00±2.89 复合棒组 20.33±1.70 25.17±1.86 28.17+2.27 28.67±1.60 阳性组 23.00±1.63 24.83±1.34 26.33+1.89 26.67±1.49 高脂组 25.17±1.34 28.50±1.12 31.67+1.80 32.67±1.49 注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01,无标注,表明不存在显著性差异(P>0.05),表2同。 表 2 复合棒对小鼠脏器指数的影响(g,x±s,n=10)
Table 2 Effect of composite rod on organ index in mice(g, x±s, n=10)
分组 心脏器指数 肝脏器指数 脾脏器指数 脑脏器指数 空白组 0.67±0.07 5.57±2.32 0.44±0.07 1.37±0.12 模型组 0.46±0.06 5.06±0.38 0.23±0.05 1.24±0.18 复合棒组 0.41±0.09 4.41±0.84 0.20±0.02 1.26±0.53 阳性组 0.42±0.05 4.18±0.74 0.19±0.03 1.18±0.06 高脂组 0.50±0.08 4.96±0.44 0.28±0.04 1.02±0.08 表 3 复合棒对小鼠血糖、血脂的影响(g,x±s,n=10)
Table 3 Effect of composite rod on blood glucose and blood lipids in mice (g, x±s, n=10)
组别 GLU(mmol/L) TG(mmol/L) HDL(mmol/L) 空白组 6±1.41 1.28±0.54 1.09±0.17 模型组 3.55±0.65* 0.88±0.21* 0.94±0.11 复合棒组 4.42±0.86# 0.62±0.29# 1.26±0.13# 阳性组 4.98±1.47 0.78±0.22 1.23±0.16 高脂组 5.58±0.65# 1.05±0.18 1.22±0.16 注:与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。 -
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