糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰岛素分泌缺陷或胰岛素抵抗导致的，以长期高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），其中T2DM占整个糖尿病比例的 90% 左右。T2DM是一种以胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）为特征的非传染性疾病，目前全球患病率呈逐年上升，严重影响人们的身心健康，已成为世界性公共卫生难题^[1−2]。长期营养过剩会引起全身脂质代谢失衡，促进肝脏对血脂的摄取，肝脏脂肪积累增加可能损害胰岛素信号传导和诱导IR^[3]。研究表明，肝脏内芳香烃受体（aromatic hydrocarbon receptor，AhR）和磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，PEMT）的过表达会引起脂质沉积，进一步阻断肝脏胰岛素信号通路转导^[4−6]。Bcl-2/腺病毒E1B-19kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B19-kDa interacting protein 3，BNIP3）与慢性肝损伤和代谢紊乱密切相关，缺失BNIP3会加剧胰岛素抵抗及代谢综合征^[7]。已有研究发现，AhR能够通过调节BNIP3减轻线粒体活性氧的产生，恢复肝脏功能性有丝分裂^[8]。本研究提出AHR有望通过调节BNIP3进而改善高脂饮食引发的胰岛素抵抗。目前糖尿病治疗药物包括双胍类、格列奈类、磺脲类等，尽管可以较好地控制血糖水平，但伴随刺激胃肠道及损害肝肾器官等副作用。传统中药在预防和改善T2DM方面表现出刺激性小、多靶点、多途径的优势^[9]，因此，开发药食同源的天然活性物质在T2DM治疗上具有重要意义。

石榴是新疆特色药食两用植物，石榴花是石榴的干燥花瓣，民间常吃石榴花用于美容养颜、润肺止咳，养阴生津等^[10−11]；现代研究表明石榴花具有降血糖、抗炎、保护肝脏等药理作用^[12]，能治疗肺结核、中耳炎等多种疾病^[13]。李彤等^[14−15]研究发现，石榴花水提物能够改善3T3-L1前脂肪细胞胰岛素抵抗。但石榴花水提物改善T2DM小鼠肝脏胰岛素信号通路与调节肝脏脂质代谢靶点的关系尚待深入研究，本研究旨从AhR/BNIP3途径调节肝脏脂质代谢探究石榴花水提物改善胰岛素信号通路的机制，以期为石榴花防治糖尿病提供参考依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

50只SPF级雄性C57BL /6J小鼠，体重范围（18~22）g　由新疆医科大学动物中心提供，动物许可证号SCXK（新）2018-0003；二甲双胍片Met　批号 170921，规格0.25 g/片，北京京丰制药有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）　纯度≥98%， 批号 S0130， 默克Sigma公司；高脂饲料　南通特洛菲饲料科技有限公司；石榴花水提取物（批号 QA20210822）　西安瑞尔丽生物工程有限公司；总胆固醇试剂盒 TC Lot 20220412、甘油三酯试剂盒 TG Lot 20220412　南京建成生物工程研究所；ELISA胰岛素试剂盒Mouse INS ELISA KIT Lot 202207　上海SinoBest；兔抗小鼠PEMT（批号 5500016734）、兔抗小鼠 AhR（批号 5500016015）　ABclonal公司；PVDF膜（批号 48659900）　Roche公司；兔抗小鼠 p-IRS1（Ser307）（批号 #35j4174）　优宁维生物公司；BCA 蛋白定量试剂盒（批号 15A022）、超敏ECL化学发光试剂盒（批号 09A062）、兔抗小鼠 AKT（批号 N12150003）、兔抗小鼠 p-AKT（Ser473）（批号 R01044074）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH（批号 N0607114）、IRS1（批号 M11303123）、兔抗小鼠 GSK3β（批号 N12301456）、兔抗小鼠 p-GSK3β（S9）（批号 N09213518）、兔抗小鼠 BNIP3（批号 R01161139）、HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）（批号 04A032）、磷酸酶抑制剂（批号 18A112）　沈阳万类公司。

KZ-III-FP型研磨仪　武汉赛维尔生物科技有限公司；AB106-N型XS205DU分析天平　梅特勒-托利多仪器公司；Multiskan GO 1.01.12酶标仪　赛默飞世尔上海仪器有限公司；MULITIFUGE X3R型低温冷冻离心机　德国Eppendorf公司；血糖仪　罗氏诊断产品有限公司；电泳仪　美国BIORAD公司；Eclipse Ni-U型光学显微镜　尼康仪器有限公司；Azure 600多功能分子成像系统　美国Azure Biosystems公司。

1.2   实验方法

1.2.1   模型制备及分组干预

C57BL/6J小鼠50只，本实验经过新疆医科大学实验动物中心伦审委员会批准，伦审号：IACUC-20220308-14，适应性3 d，按体重随机分10只为正常组（Normal）喂普通饲料，其余给予60%高脂饲料喂养6周后，禁食不禁水12 h后按85 mg/kg剂量腹腔注射2次STZ，每次间隔3 d，正常组腹腔注射同体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后，小鼠禁食不禁水8 h，尾尖采血测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），以FBG>11.1 mmol/L为造模成功，按空腹血糖值排序，每组均匀分配每区间血糖值对应小鼠，按血糖平行可比原则进行分组，最后每组8只。分别为模型组（Model）、阳性对照二甲双胍组（Met）、石榴花水提物低剂量组（PFWL）和石榴花水提物高剂量组（PFWH）。正常组与模型组给予等剂量饮用水，阳性对照二甲双胍组给予剂量为150 mg/kg进行干预，石榴花水提物低剂量组和石榴花水提物高剂量组给予剂量分别为200、400 mg/kg进行干预，所有组每天上午10:00灌胃给药1次，连续干预11周。

1.2.2   血浆及组织样本的收集

药物干预 11 周后，小鼠禁食不禁水 8 h，称小鼠体重，测小鼠空腹血糖 FBG，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉，眼眶取血，4 ℃、3000 r/min离心15 min，吸取上层血浆。颈部脱臼，摘取肝脏组织拍照并称重，一部分肝脏组织4%多聚甲醛固定，剩余肝脏组织于−80 ℃保存。

1.2.3   肝脏指数计算

根据1.2.2中得到的小鼠体重及肝脏组织重量计算肝脏指数：

1.2.4   血清生化指标测定

取1.2.2方法所得血浆，按试剂盒步骤检测TG、TC、INS指标，并根据说明书方法操作及计算公式测定小鼠血清中TC、TG、INS的含量。

1.2.5   苏木素-伊红（HE）染色

取4%多聚甲醛溶液固定的肝脏组织进行石蜡包埋，切片，按试剂盒步骤HE染色，在显微镜下观察并进行图像采集。

1.2.6   Western blotting法检测

取肝脏组织，按比例加入RIPA蛋白裂解液并研磨，12000 r/min离心15 min取上清，按BCA说明书法测浓度，制备SDS-PAGE凝胶进行电泳，结束后冰浴转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，配制磷酸化胰岛素受体底物1（p-IRS1 Ser307）（1:2000）、胰岛素受体底物1（IRS1）（1:500）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt Ser473）（1:1000）、蛋白激酶B（Akt）（1:1000）、糖原合成酶激酶-3β（Gsk3β）（1:500）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（p-Gsk3β S9）（1:1500）、芳香烃受体（AhR）（1:1000）、Bcl-2/腺病毒E1B-19kDa相互作用蛋白3（BNIP3）（1:500）、磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）（1:3000）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（1:1000）一抗4 ℃孵育过夜，0.1%TBST洗膜，二抗lg G-HRP（1:5000）室温孵育120 min，0.1%TBST洗膜，化学发光液显影成像。采用Image J分析，以GAPDH为内参，计算各目的蛋白相对表达量。

1.3   数据处理

所有数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的方差齐性采用单因素方差分析（One way ANOVA）和方差齐性采用最小显著差数（LSD）法检测组间差异比较；不符合正态分布和方差齐性采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。图像数据处理与分析采用Image J和Prism GraphPad 8.3软件。

2.   结果与分析

2.1   PFW对T2DM小鼠体重、肝重、肝脏指数的影响

如表1所示，与正常小鼠肝脏比较，糖尿病模型小鼠肝重、肝脏指数极显著增加（P<0.01）；与糖尿病模型小鼠比较，石榴花水提物高剂量组肝重、肝脏指数均显著降低（P<0.01，P<0.05），二甲双胍组肝重、肝脏指数极显著降低（P<0.01）；与二甲双胍组比较，石榴花水提物低剂量组和石榴花高剂量组没有统计学差异（P>0.05）。石榴花水提物能够减轻因高脂饮食引起的肝脏组织重量增加，且剂量相对越高，效果越好，且石榴花水提物高剂量组作用效果与二甲双胍组更相近，提示石榴花水提物高剂量改善肝脏指数具有显著效果。

表  1  PFW对T2DM小鼠体重、肝重、肝脏指数的影响（$\rm \bar{x} \pm s$）

Table  1.  Effects of pomegranate flower water extract on body weight, liver weight and liver index of type 2 diabetes mice ($\rm \bar{x} \pm s$)

组别	体重（g）	肝重（g）	肝脏指数（%）
正常组	27.66±3.39	1.18±0.07	4.29±0.41
模型组	29.58±4.10	1.59±0.36**	5.33±0.59**
二甲双胍组	30.63±4.76	1.29±0.41##	4.20±0.67##
石榴花水提物低剂量组	29.15±2.07	1.3±0.21	4.44±0.83
石榴花水提物高剂量组	29.18±2.44	1.26±0.17#	4.31±0.52##
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；表2同。

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2.2   PFW对小鼠血浆生化指标的影响

各组小鼠血浆生化指标变化如表2所示，与正常小鼠血浆比较，糖尿病模型组小鼠血浆FBG、INS、HOMA-IR、TG和TC极显著增加（P<0.01）；与糖尿病模型小鼠组血浆比较，石榴花水提物低剂量组INS和TG显著降低（P<0.01，P<0.05），石榴花水提物高剂量组FBG、INS、HOMA-IR、TG和TC均极显著降低（P<0.01），二甲双胍组FBG、INS、HOMA-IR、TG和TC极显著降低（P<0.01）；与二甲双胍组比较，石榴花水提物高剂量组没有统计学差异（P>0.05），石榴花水提物高剂量组与二甲双胍组药效数据相接近。

表  2  PFW对T2DM小鼠FBG、INS、HOMA-IR、TG、TC的影响（$\bar{{\mathrm{x}}} \pm {\mathrm{s}}$）

Table  2.  Effects of pomegranate flower water extract on FBG, INS, HOMA-IR, TG, TC in type 2 diabetes mice ($\rm \bar{x} \pm s$)

组别	FBG（mmol·L−1）	INS（mIU·L−1）	HOMA-IR	TG（mmol/L）	TC（mmol/L）
正常组	6.4±0.77	5.22±1.02	1.50±0.45	0.65±0.033	3.79±0.32
模型组	24.67±3.68**	13.54±1.20**	14.88±2.77**	1.37±0.10**	7.74±0.64**
二甲双胍组	12.91±2.15##	7.78±1.02##	4.42±0.64##	0.84±0.093##	4.44±0.11##
石榴花水提物低剂量组	23.03±3.88	10.99±0.95##	13.11±2.23	1.14±0.11#	7.09±0.36
石榴花水提物高剂量组	16.57±3.48##	9.87±0.17##	7.27±1.48##	0.90±0.057##	5.23±0.35##

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2.3   PFW对T2DM小鼠肝脏外观形态与肝脏组织病理结构的影响

各组小鼠肝脏外观形态变化如图1所示，与正常组小鼠肝脏比较，高脂诱导的糖尿病模型小鼠肝脏颜色呈土黄色、体积较大、质地较软、表面油腻颗粒感较重；与模型组小鼠肝脏比较，二甲双胍组、石榴花水提物低剂量组和石榴花水提物高剂量组肝脏颜色较红，边缘较锐化，体积减小，表面油腻感减轻，提示石榴花水提物能够减轻T2DM小鼠的肝脏油腻颗粒感，可能减少了肝脏脂质堆积。

图  1  PFW对T2DM小鼠肝脏外观形态的影响

注：正常组：Normal；模型组：Model；二甲双胍组：Met；石榴花水提物低剂量组：PFWL；石榴花水提物高剂量组：PFWH；图2~图5同。

Figure  1.  Effect of pomegranate flower water extract on liver appearance and morphology of type 2 diabetes mice

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各组小鼠肝脏组织病理结构变化如图2所示，正常小鼠肝脏组织内细胞结构正常完整，肝小叶、肝索、肝窦整齐，门区三管结构清晰，未见脂滴和病变；与正常小鼠肝脏组织比较，糖尿病模型小鼠肝组织中观察到严重的脂肪变性，肝细胞内含有大量的脂肪滴，且有部分淤血这表明该模型成功建立；与糖尿病模型小鼠肝组织比较，二甲双胍组、石榴花水提物低剂量组和石榴花水提物高剂量组肝组织轻度脂肪变性，脂肪滴明显数量减少且体积变小，肝组织病理学观察结果与肝脏外观结果一致；与二甲双胍组比较，石榴花水提物高剂量组脂肪滴明显减少，进一步证实了石榴花水提物有改善肝脏脂质沉积的作用。

图  2  PFW对T2DM小鼠肝脏组织病理结构的影响（HE， 400×）

Figure  2.  Effect of pomegranate flower water extract on liver histopathological structure in type 2 diabetes mice (HE，400×)

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2.4   PFW对T2DM小鼠肝脏胰岛素信号通路蛋白的影响

与正常小鼠肝脏比较，糖尿病模型小鼠肝脏IRS1、p-Akt（Ser473）/Akt、p-GSK3β（S9）/GSK3β蛋白表达量极显著降低（P<0.01），p-IRS1（Ser307）/IRS1蛋白表达量极显著升高（P<0.01）；与糖尿病模型小鼠比较，二甲双胍组、石榴花水提物低剂量组和石榴花水提物高剂量组IRS1、p-Akt（Ser473）/Akt、p-GSK3β（S9）/GSK3β蛋白表达量显著升高（P<0.01，P<0.05），二甲双胍组、石榴花水提物低剂量组和石榴花水提物高剂量组p-IRS1（Ser307）/IRS1蛋白表达量显著降低（P<0.01，P<0.05）；与二甲双胍组比较，石榴花水提物低剂量组和石榴花水提物高剂量组未见统计学差异（P>0.05）。结果说明石榴花水提物可以使p-IRS1（Ser307）/p-AKT（Ser473）/p-GSK3β（S9）胰岛素通路信号转导通畅（图3~图4）。

图  3  PFW对T2DM小鼠肝脏胰岛素信号通路相关蛋白条带图的影响（$\bar{{\mathrm{x}}} \pm {\mathrm{s}}$）

Figure  3.  Effect of pomegranate flower water extract on protein banding of insulin signal pathway in liver of type 2 diabetes mice ($\bar{{\mathrm{x}}} \pm {\mathrm{s}}$)

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图  4  PFW对T2DM小鼠肝脏胰岛素信号通路相关蛋白表达的影响（$\bar{{\mathrm{x}}} \pm {\mathrm{s}}$）

Figure  4.  Effect of pomegranate flower water extract on the expression of insulin signal pathway related proteins in liver of type 2 diabetes mice ($\bar{{\mathrm{x}}} \pm {\mathrm{s}}$)

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2.5   PFW对T2DM小鼠肝脏AhR、BNIP3、PEMT蛋白的影响

如图5所示，与正常小鼠肝脏比较，糖尿病模型小鼠肝脏AhR、PEMT蛋白表达量极显著升高（P<0.01），BNIP3蛋白表达量极显著降低（P<0.01）；与糖尿病模型小鼠肝脏比较，二甲双胍组和石榴花水提物高剂量组AhR、PEMT蛋白表达量显著降低（P<0.01，P<0.05），BNIP3蛋白表达量极显著升高（P<0.01）；与二甲双胍组比较，石榴花水提物高剂量组未见统计学差异（P>0.05）。结果表明，石榴花水提物可以降低AhR和PEMT蛋白的表达，升高BNIP3的表达，石榴花水提物可能通过抑制AhR的表达，来激活BNIP3的表达，从而改善肝脏脂质。

图  5  PFW对T2DM小鼠肝脏AhR、BNIP3、PEMT蛋白的影响（$\bar{{\mathrm{x}}} \pm {\mathrm{s}}$）

Figure  5.  Effects of pomegranate flower water extract on AhR, BNIP3 and PEMT protein in liver of type 2 diabetes mice ($\bar{{\mathrm{x}}} \pm {\mathrm{s}}$)

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3.   讨论与结论

糖尿病作为一种普遍的慢性代谢性疾病，其发病原因与胰岛素抵抗（IR）、肝脏脂质代谢紊乱等密切相关，目前发病率与致死率呈逐年上升的趋势，严重影响着人们的身体健康^[16−17]。

胰岛素信号转导受阻是导致2型糖尿病（T2DM）发病的重要原因之一。已有研究发现，胰岛素能与肝脏靶细胞膜上胰岛素受体结合并启动信号传导通路，激活胰岛素受体自身磷酸化，导致其底物磷酸化，进而产生生物学效应^[18−19]。IRS1是胰岛素受体酪氨酸激酶的关键靶点，是胰岛素信号通路连接细胞内外的信号蛋白^[20−21]。既往研究发现，IRS1丝氨酸（Ser307）磷酸化位点会阻碍IRS1酪氨酸位点磷酸化，IRS1（Ser307）负反馈调节胰岛素信号转导通路^[22−23]。本研究发现，石榴花水提物能够显著升高IRS1的表达并抑制IRS1丝氨酸307位点的磷酸化（IRSI Ser307），从而促进IRS1酪氨酸磷酸化，进而促进胰岛素信号的下游传导。AKT作为胰岛素信号传导中重要的下游分子，通常以p-AKT（Ser473）形式被活化，活化的AKT在调节脂质代谢、提高胰岛素敏感性、降低血糖水平方面发挥重要作用^[24−25]。本研究显示石榴花水提物激活Akt 473丝氨酸磷酸化位点从而活化Akt，进而调节脂质代谢、改善肝脏胰岛素敏感性。GSK-3β作为AKT的下游信号因子^[26]，正常情况下，活化的AKT会使GSK-3β的Ser9位点磷酸化，从而使GSK-3β失活，促进肝糖原合成，增加葡萄糖的利用率，从而降低血糖^[27]。GSK-3β过度表达或激活可导致胰岛素缺乏和IR的发生^[28]。本研究发现，石榴花水提物能抑制T2DM小鼠肝脏GSK3β表达并升高GSK-3βSer9位点的磷酸化，提示石榴花水提物提高肝脏胰岛素敏感性与调控胰岛素信号关键靶点的磷酸化有关。

脂质代谢与胰岛素信号密切相关。已有研究表明活化的AKT在调节脂质代谢方面发挥重要作用^[29−30]，GSK-3β也可调控甘油三酯、胆固醇等含量，在调节脂质沉积中起关键作用^[31]。本研究显示石榴花水提物（400 mg/kg）降低甘油三酯、胆固醇、减少肝脏脂质陈沉积的作用与二甲双胍（150 mg/kg）药效相近，提示石榴花水提物提高肝脏胰岛素敏感性、调控胰岛素信号通路与脂质代谢相关的靶点有关。本团队进一步研究了石榴花水提物对芳香烃受体（AhR）一种介导脂质沉积和胰岛素信号传导功能障碍的关键调节蛋白的影响^[32]。已知活化的AhR会诱导以甘油三酯积聚为特征的自发性肝脂肪变性^[33]。另外，肝脏中过量的胆固醇积累会进而导致β细胞功能障碍^[34]。以往研究发现，小鼠肝脏缺乏AhR及PEMT能够提高胰岛素敏感性，肝内AhR和PEMT的过表达会影响肝脏脂质代谢并导致肝脏IR的发生^[35−36]。此外，BNIP3可以作为AhR靶基因介导禁食诱导的肝脏有丝分裂，肝细胞内缺失BNIP3会导致脂肪生成增加，在高脂肪饮食期间增加有丝分裂活性或BNIP3的表达对肝脏和线粒体具有保护作用^[8,37]。本研究发现石榴花水提物降低肝脏AhR和PEMT的表达，升高肝脏中BNIP3表达，因此推测石榴花水提物可能通过抑制AhR进而促进BNIP3的表达，从而抑制肝脏脂质生成和沉积，促进胰岛素信号通路转导通畅，已知BNIP3也与自噬过程有关，推测石榴花水提物促进BNIP3的表达可能也会有助于清除肝脏中受损的线粒体，从而改善肝脏脂质代谢和胰岛素信号。另外，本研究发现二甲双胍也降低肝脏AhR和PEMT的表达，升高肝脏中BNIP3表达，因此也推测二甲双胍可能通过抑制AhR进而促进BNIP3的表达，从而抑制肝脏脂质生成和沉积，促进胰岛素信号通路转导通畅。

综上所述，本研究发现石榴花水提物能促进胰岛素信号转导通畅，可能与其调节AhR/BNIP3途径改善肝内脂质合成、减少异位脂质积聚，调控胰岛素信号关键靶点的磷酸化有关。详细机制值得进一步研究，以期石榴花可以通过调控脂质代谢途径，防治糖尿病等代谢紊乱疾病提供应用依据。