Grifola frondose Polysaccharide Regulates Proliferation, Migration and Invasion of Gallbladder Cancer Cells Through LncRNA HULC/miR-186-5p Axis
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摘要: 目的：分析灰树花多糖（Grifola frondose polysaccharide，GFP）对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法：将对数期GBC-SD细胞随机分组：对照组、GFP组（0.5、1、2 µg/mL GFP）、shNC组、shHULC组、miR-NC组、miR-186-5p mimics组、GFP+pcDNA组、GFP+pcDNA-HULC组。CCK-8法检测细胞抑制率；Transwell小室法检测GBC-SD细胞迁移和侵袭；Western Blot印迹检测Cyclin D1、P21、MMP-2、MM-9蛋白水平；qRT-PCR检测LncRNA HULC和miR-186-5p的水平；Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p的结合位点，双荧光素酶报告实验检测LncRNA HULC和miR-186-5p的靶向关系。裸鼠移植瘤实验检测GFP对GBC-SD细胞移植瘤体内生长的影响。结果：0.25~8 µg/mL GFP对胆囊癌GBC-SD细胞具有一定的抑制作用；与对照组比较，0.5、1、2 µg/mL的GFP（极）显著（P<0.05，P<0.01）抑制GBC-SD细胞迁移和侵袭，（极）显著降低Cyclin D1、MMP-2和MM-9水平（P<0.05，P<0.01），（极）显著（P<0.05，P<0.01）增加P21水平，极显著（P<0.01）下调LncRNA HULC，上调miR-186-5p的表达（P<0.05，P<0.01）；Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p存在结合位点，与miR-NC组比较，miR-186-5p mimics组HULC-WT的荧光素酶活性极显著降低（P<0.01），而HULC-MUT荧光素酶活性无统计学差异（P>0.05）；与shNC 组比较，shHULC组HULC相对表达水平极显著（P<0.01）降低，miR-186-5p相对表达水平极显著（P<0.01）增加，细胞存活率、迁移数目、侵袭数目极显著（P<0.01）降低，Cylin D1、MMP-2和MM-9水平极显著下调（P<0.01）；与GFP+pcDNA组比较，GFP+pcDN-HULC组抑制率显著降低（P<0.05），迁移数目、侵袭数目极显著增加（P<0.01），Cylin D1、MMP-2和MM-9水平显著上调（P<0.05）；与GFP+pcDNA给药组比较，GFP+pcDN-HULC给药组瘤体体积、质量极显著增加（P<0.01），miR-186-5p水平极显著下调（P<0.01）。结论：GFP可抑制胆囊癌细胞的增殖、侵袭和迁移，其机制与调控LncRNA HULC/miR-186-5p有关。
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关键词:
- 灰树花多糖 /
- LncRNA HULC /
- miR-186-5p /
- 胆囊癌 /
- 增殖 /
- 迁移 /
- 侵袭
Abstract: Objective: To analyze the effects of Grifola frondose polysaccharide (GFP) on proliferation, migration and invasion of gallbladder carcinoma cells and its mechanism. Methods: Logarithmic phase GBC-SD cells randomized: Control group, GFP group (0.5, 1,2 µg/mL GFP), shNC group, shHULC group, miR-NC group, miR-186-5p mimics group, GFP+pcDNA group, GFP+pcDNA-HULC group. Cell inhibition rate was detected by CCK-8 method. The migration and invasion of GBC-SD cells were detected by Transwell cell assay. The protein levels of Cyclin D1, P21, MMP-2 and MM-9 were detected by Western Blot. LncRNA HULC and miR-186-5p levels were detected by qRT-PCR. Starbase online software predicted the binding sites of HULC and miR-186-5p, dual luciferase reporting assay was used to detect the targeting relationship between LncRNA HULC and miR-186-5p. The effect of GFP on the endogenetic growth of GBC-SD cells was detected by tumor transplantation in nude mice. Results: 0.25~8 µg/mL GFP had definite inhibitory effect on GBC-SD cells of gallbladder carcinoma. Compared with the control group, 0.5, 1 and 2 µg/mL of GFP (extremely) significant (P<0.05, P<0.01) inhibited the migration and invasion of GBC-SD cells, and (extremely) significant (P<0.05, P<0.01) decreased the levels of Cyclin D1, P21, MMP-2 and MM-9, extremely significant increased the levels of P21 (P<0.05, P<0.01). The expression of LncRNA HULC was extremely significant down-regulated and miR-186-5p was extremely significant up-regulated (P<0.05, P<0.01). Starbase online software predicted that there was a binding site between HULC and miR-186-5p, and compared with miR-NC group, the luciferase activity of HULC-WT in miR-186-5p mimics group was extremely significant (P<0.01) decreased. There was no significant difference in the luciferase activity of HULC-MUT (P>0.05). Compared with shNC group, the relative expression level of HULC in shHULC group was extremely significant (P<0.01) decreased, the relative expression level of miR-186-5p was extremely significant (P<0.01) increased, the cell survival rate, migration number and invasion number were significantly (P<0.05) decreased, respectively, the levels of MMP-2, MMP-2 and MM-9 were extremely significant decreased (P<0.01). Compared with GFP+pcDNA group, the inhibition rate of GFP+pcDN-HULC group significantly decreased (P<0.05), and the number of migration and invasion was significantly increased (P<0.01), the CylinD1, MMP-2 and MM-9 levels were significantly increased (P<0.05, P<0.01). Compared with GFP+pcDNA administration group, tumor volume and mass in GFP+pcDN-HULC administration group were significantly (P<0.05) increased, and miR-186-5p levels were extremely significantly decreased (P<0.01). Conclusion: GFP could inhibit proliferation, invasion and migration of gallbladder cancer cells, and its mechanism was related to the regulation of LncRNA HULC/miR-186-5p.-
Keywords:
- Grifola frondose polysaccharide /
- LncRNA HULC /
- miR-186-5p /
- gallbladder cancer /
- proliferation /
- migration /
- invasion
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胆囊癌是一种常见的肿瘤，病毒感染、遗传和环境等多种因素都会导致胆囊癌的发生。尽管晚期放疗和化疗改善了胆囊癌的治疗效果，但胆囊癌患者的5年生存率仍然在50%~70%，并且胆囊癌治疗主要受肿瘤复发和远处转移的限制[1]。因此，为胆囊癌的治疗寻找新的生物标志物和新靶点具有重要意义。
灰树花是食药兼用蕈菌，它的子实体富含多种营养物质，如氨基酸、多糖和微量元素，其营养价值高于香菇[2]。研究显示，灰树花子实体肉质，清香四溢，脆嫩爽口，而且含有丰富的多糖，该多糖主要由D-葡萄糖以及D-木糖、D-焦糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、糖醛酸和半乳糖组成[3]。研究表明，灰树花多糖（Grifola frondose polysaccharide，GFP）可以通过提高机体破坏肿瘤细胞的能力，增强免疫力发挥抗肿瘤作用[4]。
根据报道，长链非编码RNA肝癌高表达转录本（LncRNA HULC）已被确定为涉及许多人类癌症的致癌基因，LncRNA HULC高表达加速了增殖、侵袭和上皮间质转化（EMT），并抑制了癌细胞的凋亡[5]。之前的报道显示miR-186-5p可作为某些癌症的生物标志物，在不同生理和病理过程中促进细胞凋亡[6−7]。而LncRNA HULC与miR-186-5p之间的联系研究甚少。最近，有人提出LncRNA的功能之一是特定的miRNA分子海绵，从而影响靶基因mRNA表达[8]。然而，灰树花多糖是否能通过调控LncRNA HULC/miR-186-5p轴影响胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭仍不清楚。
本研究通过基因敲除和过表达确定胆囊癌中LncRNA HULC和miR-186-5p相互作用的表达模式，并采用CCK-8法、Transwell 小室法评估灰树花多糖对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，从而阐明其潜在的机制。
1. 材料与方法
1.1 材料和仪器
SPF级BALB/c裸鼠 雄性，4周龄，体重15~20 g，购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，实验动物合格证号SCXK（豫）2019-0002，经漯河医学高等专科学校实验动物伦理委员会审批（审批号20220012）；人胆囊癌GBC-SD细胞株 齐氏生物科技有限公司；GFP 纯度>70%，浙江方格药业（细胞实验时溶于0.1%二甲基亚砜中，改良RPMI-1640培养基稀释。GFP进行动物实验时，采用PEG400溶解，配制成40 mg/mL母液体，体内实验时生理盐水稀释，4 ℃保存备用）；Trizol试剂 上海碧云天生物技术有限公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒 南京建成生物研究所；Transwell细胞小室 美国Corning；Matrigel基底膜基质 美国BD Biocoat；shHULC、miR-186-5p mimics、pcDNA-HULC、含miR-186-5p结合位点的野生型HULC荧光素酶报告质粒（HULC-WT）、含miR-186-5p结合位点突变的突变型HULC荧光素酶报告质粒（HULV-MUT） 上海吉玛制药技术有限公司；兔抗人CylinD1、P21、MMP-2、MM-9、β-actin抗体、HRP标记的羊抗兔IgG二抗 美国Sigma公司。
CKX41-C31B倒置荧光显微镜 奥林巴斯（中国）有限公司；ELx-800酶标仪 BioTek公司；恒温恒湿培养箱 德国Binder公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司；U3000标准双系统液相色谱 赛默飞公司。
1.2 实验方法
1.2.1 灰树花多糖的提取
灰树花的干燥子实体采用沸水（料液比1:50 g/mL）提取三次，合并上清液，将上清液浓缩，然后80%乙醇沉淀，1/3体积的Sevag试剂混合，重复脱蛋白3次。然后冷冻干燥获得粗多糖。然后，使用配备有TSKgel G4000 PWXL柱和示差折光检测器（Refractor Max 521）的Thermo Fisher U3000半制备系统进行的纯化，获得GFP，苯酚-硫酸法测定多糖含量，其主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖以26.2:1.1:1.3的比例组成[9]。
1.2.2 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞增殖的影响
GBC-SD在添加10%胎牛血清的改良RPMI-1640培养基中培养，37 ℃和5% CO2恒温恒湿培养箱中孵育，0.25%胰酶消化传代。选择对数生长期GBC-SD细胞接种96孔板（4×103 个/孔），贴壁后，加入终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8 µg/mL GFP，同时设置阳性对照组（10 µg/mL 5-氟尿嘧啶，5-FU，预实验）和0.1%的DMSO组，每组3个复孔，孵育48 h。每孔加入10 μL CCK-8，孵育1.5 h，酶标仪450 nm检测OD值[10]。其中抑制率（%）=（对照组OD值−给药组OD值）×100/（对照组OD值−空白对照组OD值）。
1.2.3 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞CylinD1、P21蛋白水平的影响
采用Western Blot法检测。对数期GBC-SD细胞随机分组：对照组（0 µg/mL GFP）、GFP组（0.5、1、2 µg/mL GFP），处理48ｈ。使用预冷的RIPA裂解缓冲液裂解给药或转染48 h的GBC-SD细胞，然后将转移至EP管细胞在冰上保持30 min。4 ℃ 14000 r/min离心10 min后，收集上清液并使用Bradford方法测定蛋白质浓度。添加Loading buffer后，蛋白质样品在100 ℃下变性5 min。随后，每组10 µL蛋白质样品进行SDS-PADE电泳，然后转移到PVDF膜。用5% BSA封闭 1 h后，与一抗在4 ℃下孵育过夜。一抗稀释如下：CylinD1（1:2000）、P21（1:2000）、β-肌动蛋白（1:3000）。TBST洗涤三次，与山羊抗兔二抗（1:1000）在室温下孵育1 h。通过化学发光法观察膜上的蛋白质条带[11]。
1.2.4 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞侵袭和迁移的影响
Transwell小室法检测。对数期GBC-SD细胞随机分组：对照组（0 µg/mL GFP）、GFP组（0.5、1、2 µg/mL GFP）。将200 µL GBC-SD细胞（密度为1.0×105 个/mL）接种到Transwell小室上室的无血清培养基中，下室补充500 µL含10% FBS的RPMI-1640培养基。培养48 h，膜的上表面用棉签去除，而下表面的细胞用0.1%结晶紫染色30 min。倒置显微镜计数。细胞侵袭在上室中加入Matrigel，其余步骤同迁移实验[12]。Western Blot法检测MMP-2、MMP-9蛋白水平。
1.2.5 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞LncRNA HULC、miR-186-5p表达的影响
采用qRT-PCR检测。对数期GBC-SD细胞随机分组：对照组（0 µg/mL GFP）、GFP组（0.5、1、2 µg/mL GFP），处理48 ｈ。使用TRIzol试剂（nvitrogen）提取总RNA，并逆转录成cDNA。内参基因选择GAPDH和U6，采用基于SYBR Green的定量检测系统（Bio-Rad）进行PCR扩增。HULC引物序列：上游序列：5´-TTGGGCGAGACCTACCTAGT-3´，下游序列：5´-TGCCAGGAAACTTCTTGCTTG-3´，85 bp；GAPDH引物序列：上游序列：5´-CTCAGACACCATGGGGAAGG-3´，下游序列：5´-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3´，207 bp；miR-186-5p引物序列：上游序列：5´-TCGTATCTCGCAGCTCATTGTTA-3´，下游序列：5´-GTTACACTGCTTGATTGCCTTCAC-3´；U6引物序列：上游序列：5´-CGGCTGTTACGGCATGGA-3´，下游序列：5´-GTTTAAGCGAGCTTGGTGCC-3´；PCR反应条件：95 ℃、20 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，70 ℃、1 s，共40个循环。2−ΔΔCt法计算HULC、miR-186-5p的相对表达水平[13]。
1.2.6 荧光素酶报告基因实验分析
利用 Lipofectamine2000将构建含有miR-186-5p结合位点的HULC野生型和突变型重组质粒（HULC-WT/MUT）分别与miR-NC、miR-186-5p mimics转染到胆囊癌细胞中，48 h后。双荧光素酶活性检测试剂盒评估荧光素酶活性[14]。
1.2.7 HULC低表达抑制GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移
对数期GBC-SD细胞随机分组：shNC组（转染50 nmol/L HULC阴性序列）、shHULC组（转染50 nmol/L HULC基因干扰序列）。将GBC-SD细胞接种６孔板（2×105个/孔），参照说明书，通过Lipofectamine 2000试剂进行转染，采用RT-qPCR检测转染效率，转染成功后进行继续均处理48 ｈ。shRNA序列如下：HULC-shRNA：（5´-GAAUUAUGUUGUUAUCAAAGA-3´），shRNA-NC（5´-GGAAUCGUCCGAGGAACAGAC-3´）。qRT-PCR检测LncRNA HULC、miR-186-5p表达水平，CCK-8法检测细胞存活率，Transwell小室法检测GBC-SD细胞侵袭和迁移，Western Blot法检测CylinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平。其中细胞存活率（%）=（给药组OD值−空白对照组OD值）×100/（对照组OD值-空白对照组OD值）。
1.2.8 HULC高表达逆转了灰树花多糖对 GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移的影响
对数期GBC-SD细胞随机分组：GFP+pcDNA组（转染2 µg pcDNA并给予2 µg/mL GFP）、GFP+pcDNA-HULC组（转染2 µg pcDNA-HULC并给予2 µg/mL GFP）。以上均处理48 ｈ。 qRT-PCR 检测LncRNA HULC表达水平，CCK-8法检测细胞抑制率，Transwell小室法检测GBC-SD细胞侵袭和迁移，Western Blot法检测CylinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平。
1.2.9 动物实验
依据预实验设置裸鼠最小剂量（Dm）和最大剂量（Dn），等比数列设置5个组别（r=0.7），每组10只，每天灌胃1次，持续观察14 d，计算LD50[15]。
将0.2 mL含2×105个稳定表达pcDNA-HULC或非编码pcDNA细胞接种到BALB/c 裸鼠的侧腹，每组6只。当肿瘤达到50~100 mm3时，分为模型组（生理盐水）、GFP（50 mg/kg）+pcDNA给药组和GFP（50 mg/kg）+pcDNA-HULC给药组、5-FU组（5-氟尿嘧啶，20 mg/kg，预实验获得），均为腹腔给药，1次/3 d，每周一次用游标卡尺评估肿瘤大小。肿瘤体积（mm3）=宽度2×长度/2。第21 d，对肿瘤进行解剖、拍照和称重，并分析肿瘤中的miR-186-5p水平。
1.3 数据处理
采用SPSS21.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P<0.05或P<0.01时认为差异有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞增殖的影响
本研究中，选择胆囊癌GBC-SD作为研究对象，分析了GFP对胆囊癌细胞的影响，结果显示，0.25~8 µg/mL GFP对胆囊癌GBC-SD细胞具有一定的抑制作用（图1A），并呈现明显的浓度效应，这也说明GFP除了对结肠癌等具有一定的抑制作用[16]，针对胆囊癌也能发挥较好的抑癌作用，通过SPSS21.0软件进行统计分析，其IC50值为2.24 µg/mL，考虑到后续实验的需要，设置0.5、1、2 µg/mL三个浓度组进行后续研究。
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图 1 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞增值的影响注：与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。Figure 1. Effect of GFP on proliferation of GBC-SD cells in gallbladder carcinoma考虑到GFP对胆囊癌GBC-SD细胞的抑制作用，本研究继续针对增殖相关的蛋白Cyclin D1、P21进行了分析，其中Cyclin D1能促进细胞周期由G1期进入到S期，而P21能协调细胞周期、DNA复制与修复[17]。结果显示，0.5、1、2 µg/mL的GFP对增值相关蛋白Cyclin D1具有（极）显著（P<0.05，P<0.01）的抑制作用，而对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21具有（极）显著（P<0.05，P<0.01）的促进作用（图1B~图1C），说明GFP能通过调控Cyclin D1和P21水平抑制GBC-SD细胞增值。
2.2 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞侵袭和迁移的影响
本研究选择0.5、1、2 µg/mL 三个浓度针对胆囊癌GBC-SD细胞迁移和侵袭进行了分析。结果显示，0.5、1、2 µg/mL GFP组细胞发生侵袭和迁移的细胞数（极）显著（P<0.05，P<0.01）低于对照组，说明0.5、1、2 µg/mL的GFP能显著抑制胆囊癌GBC-SD细胞迁移和侵袭（图2A~图2B），这与GFP针对其他癌细胞的研究基本一致[18−20]，这也提示GFP抑癌范围较广。
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图 2 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞迁移和侵袭的影响注：图2A放大倍数为200；与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。Figure 2. Effect of GFP on migration and invasion of BGC-SD cells in gallbladder carcinoma考虑到GFP能抑制胆囊癌GBC-SD细胞迁移和侵袭，本研究继续针对侵袭和迁移相关的蛋白进行了分析，以揭示其发挥作用的机制。WB实验结果显示，0.5、1、2 µg/mL的GFP能（极）显著（P<0.05，P<0.01）降低MMP-2、MMP-9水平（图2C~图2D），而MMP-2、MMP-9可以刺激整合素信号传导并促进细胞迁移[21]和侵袭[22−23]，这也说明GFP能通过降低基质金属蛋白酶（MMPs）的表达从而抑制胆囊癌GBC-SD细胞迁移和侵袭。
2.3 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞LncRNA HULC、miR-186-5p表达的影响
本研究结果表明，0.5、1、2 µg/mL的GFP能显著抑制胆囊癌GBC-SD细胞的增殖，但其机制还不太明确。考虑到LncRNA HULC能通过抑制肿瘤抑制基因的表达而促进癌细胞增殖[24−25]，同样，miR-186-5p能通过靶向相关的信号通路参与癌细胞的不同功能，如增殖和转移[26]。因此本研究探讨了GFP对胆囊癌GBC-SD细胞LncRNA HULC、miR-186-5p表达的影响。结果表明，GFP能极显著（P<0.01）降低LncRNA HULC水平，增加miR-186-5p水平（图3A），提示GFP抑制胆囊癌GBC-SD细胞的增殖可能与调控LncRNA HULC、miR-186-5p表达水平有关。
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图 3 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞LncRNA HULC、miR-186-5p表达的影响注：与对照组比较，**P<0.01；与miR-NC组比较，**P<0.01。Figure 3. Effect of GFP on LncRNA HULC and miR-186-5p expression in GBC-SD cells of gallbladder cancerStarbase在线软件预测HULC与miR-186-5p存在结合位点（图3B）。而且通过荧光素酶活性比较也证实了上述的预测，其中与miR-NC组比较，miR-186-5p mimics组HULC-WT的荧光素酶活性极显著（P<0.01）降低，而HULC-MUT荧光素酶活性无统计学差异（P>0.05）（图3C），说明miR-186-5p可以结合HULC，抑制HULC的表达，同时也提示LncRNA HULC具有“分子海绵” 功能，能通过吸附降低特定组织的miRNA表达水平。同时进一步说明GFP抑制胆囊癌GBC-SD细胞的增殖可能与调控LncRNA HULC/miR-186-5p信号通路有关。
2.4 HULC低表达抑制GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移
HULC为一种致癌基因，在癌细胞中高表达，促进癌细胞增殖、迁移和侵袭[27]，而miR-186-5p在多种癌细胞中低表达，抑制癌细胞的增殖和转移[28]。在本研究中，与shNC组比较，shHULC组HULC相对表达水平极显著（P<0.01）降低，并进一步影响miR-186-5p的表达水平（图4A），细胞存活率极显著（P<0.01）降低（图4B），减少迁移和侵袭细胞数目（图4C~图4D），这与上述研究结果基本一致，这也说明HULC可以通过调控miR-186-5p的表达水平影响GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移。而细胞增殖、侵袭和迁移一般与周期蛋白、基质金属蛋白酶的表达水平有关，在本研究中，HULC低表达极显著降低CylinD1、MMP-2和MM-9水平（P<0.01）（图4E~图4F），这也说明HULC低表达可以进一步影响Cylin D1、MMP-2和MM-9水平，从而调控细胞增殖、侵袭和迁移。
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图 4 HULC低表达抑制GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移注：图4C放大倍数为200；与shNC组比较，**P<0.01。Figure 4. Low expression of HULC inhibits the proliferation, invasion and migration of GBC-SD cells2.5 HULC高表达逆转了灰树花多糖对 GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移的影响
在肿瘤中，HULC本身是一种特性良好的致癌LncRNA，高表达HULC可以调节癌细胞行为和增加化疗敏感性，降低药效[29]。本研究中，与GFP+pcDNA组比较，GFP+pcDN-HULC组抑制率显著（P<0.05）降低（图5B），迁移数目、侵袭数目极显著（P<0.01）上调（图5C~图5D），说明HULC高表达逆转了灰树花多糖对GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移的影响。同样，与GFP+pcDNA组比较，GFP+pcDNA-HULC组Cylin D1、MMP-2和MM-9水平极显著（P<0.01）增加（图5E~图5F），这也说明HULC高表达可以进一步调控GFP对Cylin D1、MMP-2和MM-9水平的影响，并调控细胞增殖、侵袭和迁移（图5E~图5F）。
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图 5 HULC高表达逆转了灰树花多糖对GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移的影响注：与GFP+pcDNA组比较，*P<0.05，**P<0.01；图5C放大倍数为200。Figure 5. High expression of HULC reversed the effects of polysaccharide on the proliferation, invasion and migration of GBC-SD cells2.6 HULC高表达逆转GFP在体内抑制胆囊癌肿瘤生长
本研究Dn（最大剂量）为5500 mg/kg，灌胃后，部分裸鼠出现发抖、怕冷，扎堆，0.5 h后恢复正常，无死亡发生，参照外源化学物相对毒性分级标准，一次经口LD50在5000 mg/kg以上为无毒[30]，因此可以认为灰树花多糖无毒。同时结合预实验，最终确定给药剂量为50 mg/kg。
为了证明HULC作为具有巨大临床潜力的治疗靶点，本文对HULC过表达对肿瘤生长的影响进行了体内评估。结果显示，与GFP+pcDNA给药组比较，GFP+pcDN-HULC给药组肿瘤体积和质量极显著（P<0.01）增加，说明HULC过表达能逆转GFP对肿瘤大小和肿瘤重量的影响（图6A~图6B）。此外HULC过表达也调控了肿瘤中的miR-186-5p表达水平，其中与GFP+pcDNA给药组比较，GFP+pcDN-HULC给药组miR-186-5p水平极显著（P<0.01）降低，提示GFP可能通过调控HULC表达水平，并进一步影响肿瘤中的miR-186-5p的表达（图6C），并最终发挥抑瘤活性。
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图 6 HULC高表达逆转GFP在体内抑制胆囊癌肿瘤生长注：与对照组组比较，**P<0.01；与GFP+pcDNA给药组比较，##P<0.01。Figure 6. HULC high expression reverses GFP inhibition of gallbladder cancer tumor growth in vivo3. 结论
本实验旨在研究灰树花多糖对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并分析其机制。本研究中，0.25~8 µg/mL GFP对胆囊癌GBC-SD细胞具有一定的抑制作用，其中0.5、1、2 µg/mLGFP（极）显著（P<0.05，P<0.01）抑制GBC-SD细胞侵袭和迁移，极显著（P<0.01）下调LncRNA HULC，极显著（P<0.01）上调miR-186-5p水平。此外，Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p存在结合位点，下调HULC将进一步影响miR-186-5p的表达水平，细胞存活率极显著（P<0.01）降低，迁移数目、侵袭数目极显著（P<0.01）下调，而HULC过表达，可以逆转GFP对GBC-SD细胞增值、迁移和侵袭的影响，体内实验同样证明了上述观点，说明GFP能通过调控LncRNA HULC、miR-186-5p影响胆囊癌GBC-SD细胞增值、迁移和侵袭，从而阐明了灰树花多糖抗胆囊癌的基本机制，为胆囊癌的发生机制、临床治疗提供参考，同时也为灰树花多糖的进一步开发提供依据。
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图 1 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞增值的影响
注：与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。
Figure 1. Effect of GFP on proliferation of GBC-SD cells in gallbladder carcinoma
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图 2 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞迁移和侵袭的影响
注：图2A放大倍数为200；与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。
Figure 2. Effect of GFP on migration and invasion of BGC-SD cells in gallbladder carcinoma
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图 3 GFP对胆囊癌GBC-SD细胞LncRNA HULC、miR-186-5p表达的影响
注：与对照组比较，**P<0.01；与miR-NC组比较，**P<0.01。
Figure 3. Effect of GFP on LncRNA HULC and miR-186-5p expression in GBC-SD cells of gallbladder cancer
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图 4 HULC低表达抑制GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移
注：图4C放大倍数为200；与shNC组比较，**P<0.01。
Figure 4. Low expression of HULC inhibits the proliferation, invasion and migration of GBC-SD cells
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图 5 HULC高表达逆转了灰树花多糖对GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移的影响
注：与GFP+pcDNA组比较，*P<0.05，**P<0.01；图5C放大倍数为200。
Figure 5. High expression of HULC reversed the effects of polysaccharide on the proliferation, invasion and migration of GBC-SD cells
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