Chinese Human Milk Omics: Cohort Study and Industrial Application
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摘要: 母乳为婴儿提供个性化、全面、均衡的营养成分以及免疫保护，是0~6月婴儿的最佳营养来源，是婴儿食物的金标准。母乳组学队列研究是全面解析中国母乳组成特征、建立中国婴儿食品规范与标准、制定婴儿营养指南、创制婴儿食品的必要前提。本文介绍了国家母婴乳品健康工程技术研究中心基于中国母婴营养健康出生队列研究（China maternal and infant nutrition health birth cohort study，MINC）的母乳脂质组学、糖组学、蛋白质组学和微生物组等组学检测技术、组成特征、与牛乳的差异及其在婴儿食品中的产业化应用等方面的研究进展，以期为母乳组学队列研究、模拟与产业化应用提供科技支撑与示范。Abstract: Human milk, which provides personalized, comprehensive, and balanced nutrients, and immune protection, is the best nutritional source for 0~6 month-old infants, and it is the gold standard for infant food. A cohort study of human milk omics is a necessary prerequisite for comprehensively analyzing the composition and characteristics of Chinese human milk, establishing Chinese infant food norms and standards, developing infant nutrition guidelines, and creating infant foods. This article presents the research progress of the National Engineering Research Center of Dairy Health for Maternal and Child pertaining to the China Maternal and Infant Nutrition Health Birth Cohort Study (MINC) in terms of breast milk lipidomics, glycomics, proteomics, and microbiomics detection techniques, composition characteristics, differences from bovine milk, and industrial applications in infant food. This will lay a science and technical support for the omics research of Chinese human milk and provide the necessary data and demonstration for industrial application.
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母婴营养健康是国民健康的基础[1]，生命早期1000 d营养是影响一生健康的可控关键因素。母乳可以提供个性化、全面、均衡的营养成分和活性物质，是0~6月婴儿的最佳营养来源[2]，是婴儿食物的金标准，因此基于队列研究，解析中国母乳组成是提升我国婴儿近远期健康水平的必要前提。
母乳由脂质、碳水化合物、蛋白质、矿物质、维生素、免疫活性物质、微生物和细胞等组成，且每种成分的种类丰富。例如，母乳脂质组由甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、游离脂肪酸等亚类组成，每个亚类根据脂肪酸分子的不同，形成400多种不同分子[3]；母乳中的碳水化合物除乳糖外，还含有由D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺、L-岩藻糖、N-乙酰神经氨酸5种单体组成的1000余种母乳低聚糖（Human Milk Oligosaccharides，HMOs）分子[4]；母乳总蛋白质中含有500余种酪蛋白[5]、800余种乳脂肪球膜蛋白[6]和其他活性蛋白；母乳微生物组在属的水平目前分析到了290余种[7]，且通过分离和益生特性研究获得了格氏乳杆菌等多种益生菌[8]；母乳矿物质含常量元素、微量元素及其他共10余种；母乳维生素包括脂溶性维生素A、维生素D、维生素E、维生素K和水溶性维生素B和维生素C，每种维生素又含有不同结构的分子种类；母乳中含有至少10种细胞[9]；母乳外泌体是具有膜结构的囊泡，含有蛋白质、脂质、核酸等生物活性物质；此外，母乳中还有核苷酸、激素、细胞因子等活性成分。
母乳组成不仅随着泌乳阶段发生显著的变化，且受基因、地域、膳食等因素的影响[10]，因此基于中国代表性母婴营养队列，解析中国母乳组成是提升中国婴儿早期营养水平的关键。目前，我国分别报道了相关队列研究[11]和脂质组、糖组、蛋白组、微生物组等组学分析方法，但是缺乏基于代表性队列的组学系统分析，尤其未见中国代表性队列母乳与现有婴配粉组成与功效的组学研究。
国家母婴乳品健康工程技术研究中心（以下简称“国家母婴研究中心”）开发了母婴营养健康调研与管理系统，创新了“应用基础研究-工业技术开发-临床医学循证-产业示范引领”的母婴乳品研发模式，突破了母婴乳品功效评价技术， 开发了更适合中国母婴营养健康的系列乳品。基于2014年启动的我国多地区、长时间追踪的母婴营养队列研究项目——中国母婴营养健康出生队列研究（China maternal and infant nutrition health birth cohort study，MINC），建立了跨7个省市、8个饮食圈、15个点的多点多中心、前瞻性母婴营养队列，入组母婴3766人，收集母乳、粪便、尿液等生物样本28354份，其中母乳样本4728份[12]；创新建立了母乳脂质组[13]、糖组[14-16]、蛋白质组[6,17]、矿物质[18]和维生素[19]等检测方法，对比解析了母乳、牛乳和婴幼儿配方奶粉的相关成分组成、结构和含量[6,20-21]，通过功能成分的科学配比设计了婴幼儿配方食品[22-24]，研制了孕产妇乳品，并通过动物模型和临床队列，采用组学技术评价了作用功效[25-27]，为母乳组学队列研究、模拟与产业化应用提供科技支撑与示范。
1. 中国母乳组学检测技术
采用组学检测技术，从分子水平解析母乳组成是中国母乳组学研究的重要基础。尽管组学技术在生命科学领域开始应用，但是在食品领域，尤其是组成复杂的母乳研究中的应用还较少。母乳含不同种类、不同性质的成分，在分子水平有几千种物质，复杂的组成给样品的前处理、检测结果的分析带来挑战。因此，创新母乳组学检测技术成为解析母乳组学必须攻克的技术难点。
1.1 脂质组学
脂质是母乳中仅次于乳糖的第2大组分，主要包括甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、脂肪酸、固醇脂和糖脂等[28]。在母乳中，脂质含量占3%~5%，其中甘油酯占98%~99%，磷脂占0.26%~0.80%，游离脂肪酸占0.08%~0.40%，胆固醇占0.25%~0.34%，神经节苷脂占0.001%[29-30]。研究表明母乳脂质不仅为婴幼儿生长发育提供45%~55%的能量[31-32]；还是细胞和细胞器膜结构不可缺少的成分，具有抵抗各种代谢疾病[33]、促进大脑和神经发育等功能[34]。因此，基于脂质组学技术了解母乳中的脂质组成至关重要。
传统的液液萃取（Liquid-liquid extraction，LLE）方法是常用的提取脂质的方法，主要包括Folch法[35]和Bligh&Dyer法[36]，但LLE难以将高浓度高油脂和低浓度磷脂等极性脂分离，同时检测导致定量不准确。脂质检测的方法主要有高效液相色谱-蒸发光检测器法（High-performance liquid chromatographic method with evaporative light scattering detection，HPLC-ELSD）[37]、气相色谱-质谱联用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[38]、超临界流体色谱-质谱联用法（Supercritical fluid chromatography-mass spectrometry，SFC-MS）[39]、高效液相色谱-飞行时间质谱联用法（Liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry，LC-TOF-MS）[40]等，其中LC-TOF-MS具有扫描速度快、离子传递率快、检测灵敏度高等优势。
因此，国家母婴研究中心采用内标法[40]，建立了液液-固相联合萃取技术，同时提取出含有神经节苷脂的水相和含有磷脂、甘油酯、游离脂肪酸的有机相，并通过固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）分离出磷脂；采用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间质谱分别对磷脂（包括PC、PE、PI、PS、PG、PA）、甘油酯（DAG、TAG）、神经节苷脂（GM3、GD3）、游离脂肪酸（FFA）进行检测[40-42]。该方法具有精密度高、灵敏度高、稳定性好和重复性强的特点，同时检测到的脂质种类优于多数已有研究。此外，还建立了GC-MS检测脂肪酸和Sn-2位脂肪酸含量[43-44]的方法，以研究模拟母乳脂肪酸和Sn-2位脂肪酸组成。
1.2 糖组学
HMOs是母乳的重要成分，由于其结构多样性，使其具有许多有益的生物学功能，包括“双歧因子”效果、抗黏附、抗菌、调节肠道上皮细胞和免疫细胞、减少过度的黏膜白细胞浸润和活化、降低新生儿坏死性小肠结肠炎等功效，并为婴幼儿大脑发育和认知提供潜在的必要的唾液酸营养素[4]。
目前检测母乳低聚糖的方法主要有毛细管电泳[45]、气相-质谱联用[9,46]和核磁共振等[47]，但应用较少。主要是因为毛细管电泳法不易区分同分异构体；气质联用难以检测分子量较大难以气化的低聚糖；核磁共振设备昂贵、日常维护费用高等。母乳中73%的唾液酸是以低聚糖结合的形式存在，其他为蛋白结合、脂质结合和游离形式存在[48]，但目前未有适用于检测母乳和婴配粉中不同结合形式唾液酸的方法[49]。
针对上述问题，陈历俊团队基于分析物的组成、电荷、大小、结构、连接键和支链构成等属性，建立了高通量定性[14-16]、定量检测母乳和牛乳低聚糖的方法[21,50-51]，该方法样品前处理简单、快速，仅需要离心去除大多数脂肪，无需去除乳糖和分离中酸性低聚糖就可以检测乳中主要的低聚糖，适用于大规模的母乳样品分析工作。同时，建立了高效阴离子交换色谱-脉冲安培法检测母乳和婴儿配方粉中不同结合形式唾液酸 N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolyl neuraminic acid，Neu5Gc）的方法[51]，方法样品处理简单，具有较低的检出限与定量限，较宽的线性范围，较好的稳定性，良好的重复性与回收率，能广泛用于乳基唾液酸的检测。
1.3 蛋白组学
母乳中的蛋白质包括乳清蛋白、酪蛋白、乳脂肪球膜蛋白（Milk fat globule membrane，MFGM）和外泌体蛋白等，具有增加营养代谢、刺激生长和免疫调节等功能。当前乳清蛋白和酪蛋白研究较多，尽管乳脂肪球膜蛋白的丰度较低，仅占乳中总蛋白的1%~2%，但其可在新生儿中的各种细胞过程和防御机制方面发挥作用，具有抗癌、抗菌和抗黏着性以及对脑脊髓炎的自身免疫作用等。
蛋白组学样品的前处理技术包括蛋白质提取和酶解等关键步骤，主要有二维液相色谱分离法、超滤管辅助样品前处理法及亲和去垢小柱前处理法等[52]。检测方法主要有免疫共沉淀、双向电泳、蛋白质芯片、高分辨质谱检测等技术。
陈历俊团队[6]早在2016年，基于蛋白组学研究技术，采用超高速离心提取的方法，从牛乳和母乳中分离提取乳脂肪球膜蛋白，经超滤管辅助酶解法前处理，用NanoLC-Orbitrap MS 技术分析酶解后的肽段，与Uniprot 数据库检索比对识别蛋白质，并利用PAN-THER 数据库对所识别的肽段匹配数≥2 的蛋白质进行基因本体功能注释和分类，为母乳乳脂肪球膜蛋白的解析提供了技术支撑。
1.4 矿物质和维生素
矿物质作为母乳中微量的营养素，对维持婴儿的正常生理功能和生长发育发挥重要的作用。母乳中的矿物质包括常量元素（K、Ca、Na、Mg和P等），必需微量元素（Cu、Mn、Zn、Fe和Se等）及其他元素（Pb、Cr、Hg和As等）。目前母乳中矿物元素的检测方法主要有原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、 紫外-可见分光光度法、离子色谱法、电感耦合等离子体-发射光谱法（Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometer，ICP-OES）、电感耦合等离子体-质谱法（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）等。其中，ICP-OES法和ICP-MS法已经列入我国国标检测方法《食品中多元素的测定》（GB 5009.268-2016）[53]。国家母婴乳品中心建立了ICP-MS法[18]检测母乳中矿物元素含量的方法，具有样品需求量少、分析速度快、准确度和灵敏度高、检测限低和线性范围宽等优点，可用于同时检测样品中多种矿物元素的含量，实现大批量样本的快速检测。
维生素是许多不同类型的低分子量有机化合物，具有不同的结构和功能，可维持婴儿的生长发育和抗氧化特性。按溶出方式不同，母乳中的维生素可分为水溶性维生素和脂溶性维生素两类。水溶性维生素主要包括维生素C和B族维生素。脂溶性维生素主要包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。近年来，母乳中维生素的测定方法主要有高效液相色谱法HPLC、荧光光度法、液相色谱串联质谱法和微生物法，目前维生素的含量测定多采用高效液相色谱法，然而，母乳中一些B族水溶性维生素由于其含量极低，HPLC的检测器无法检测到，需要通过耗时的微生物法进行检测。LC-MS/MS简化了上述方法的前处理过程，缩短了检测时间，可实现批量样品的高通量测定[19]。
陈历俊团队[19]建立了UPLC法检测母乳中脂溶性维生素含量的方法，具有试样前处理简单、分析速度快、线性范围宽等优点，可用于同时检测维生素A、维生素D、维生素E和β-胡萝卜素的含量，实现大量样本的快速检测；开发的UPLC-MS法检测母乳中水溶性维生素含量的方法，具有前处理过程简单、耗时短等优点，可同时检测9种维生素含量，包括含量较低的B族维生素，实现了批量样本的高通量检测。
1.5 益生菌
母乳源益生菌和其他来源的益生菌相比，在安全性和益生功能方面具有天然的优势，对塑造婴儿肠道菌群的构成和肠道粘膜免疫的发育成熟，具有非常重要的作用[54]。因此，母乳源益生菌被称“奶白金”，是益生菌中的“贵族”。目前分离到的母乳益生菌有发酵粘液乳杆菌CECT5716 （Limosilactobacillus fermentum CECT5716），证明能改善肠易激综合征[55]，减轻哮喘的炎症反应[56]，调节肠道菌群，防止肥胖[57]，改善系统性红斑狼疮导致的高血压和肾损伤[58]；罗伊氏粘液乳杆菌DSM17938 （Limosilactobacillus re-uteri DSM17938）具有缓解婴幼儿肠绞痛功能[59]；乳双歧杆菌Probio-M8 （Bifidobacterium lactis Probio-M8）证明能调节肠道菌群，改善绝经后的骨质疏松[60]、酒精性脂肪肝[61]，减轻阿尔兹海默症症状[62]等功能。
母乳益生菌丰度非常低，每毫升母乳大约含有103~104 CFU/mL[63]，因此，分离培养有较大难度。随着微生物培养组学的发展[64]，越来越多的母乳源益生菌被成功分离培养出来。另外，细菌全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）、比较基因组学、16S rRNA测序和宏基因组测序技术也被应用到母乳菌群构成和功能预测的分析[65]。反向基因组学利用靶向细菌膜蛋白特定表位的抗体，可从菌群中分离出特定的微生物[66]。单细胞基因测序技术可对微生物群中具有特定功能而未培养微生物进行深入的表征分析[67]。通过与抗生素抗性基因数据库（Antibiotic resistance genes database，ARDB）、毒力因子数据库（Virulence factors database，VFDB）和功能基因数据库的比对和预测，能更快地筛选出具有益生功能的益生菌。此外，转录组学、代谢组学和蛋白质组学也被用于益生菌的研究，鉴定微生物合成和分泌的蛋白[68]，对于预测益生菌潜在的益生功能具有一定的价值。
国家母婴研究中心采用组学技术深入揭示菌株遗传信息，建立益生菌快速、精准筛选方法和功能预测技术，有目标地筛选功能益生菌，减少了益生菌筛选周期，提高了筛选效率。
1.6 细胞和外泌体
母乳中含有细胞已被国外内公认[69]。受母乳内细胞数量少、种类多和难获得等的限制，母乳内细胞的主要检测手段是单细胞组学和流式细胞分选技术[9,69]。研究团队初步建立了母乳中不同细胞分离鉴定的方法。外泌体是细胞处于生理（或病理）状态下主动分泌产生的直径在 30~200 nm，密度为 1.13~1.19 g/mL的具有双层膜结构的圆形或是椭圆形囊泡，母乳内也含有外泌体[70]，而且随着泌乳阶段的改变而不断变化，它含有许多生物活性成分，如mRNA、miRNA、脂类和蛋白质。母乳内外泌体的提取方法主要有：离心法、化学沉淀法、免疫亲和法、尺寸排阻法、微流控技术等[71]。根据外泌体的生物特征，陈历俊团队建立了超速离心法和化学沉淀法提取母乳外泌体，并通过投射电镜鉴定。
2. 中国母乳组学队列研究
采用组学检测技术开展母乳组学的队列研究是揭示中国母乳变化规律与特征，并创制组成更加接近中国母乳的婴儿食品的必要前提。
2.1 脂质组学
国家母婴研究中心基于液质分析表明，来自中国不同城市（北京、浏阳、洛阳和唐山）、不同阶段（初乳、过渡乳和成熟乳）的母乳共有484种脂类；中国母亲母乳中1（3）-油酸-2棕榈酸-3（1）-亚油酸甘油三酯（1-palmitoyl-2-oleoyl-3-linoleoylglycerol，OPL）含量普遍高于1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（1,3-Dio-leoyl-2-palmitoyl triglyceride，OPO）；极性脂类中SM（75.38 mg/L，40.39%）、PE（51.12 mg/L，27.39%）和PC（40.10 mg/L，21.49%）的含量最高[3]，其中主要包括SM 42:2:2（22.24 mg/L）、PE 36:2（C18:0~C18:2，21.39 mg/L）和PC 36:2（C18:0-C18:2，19.80 mg/L）；花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）的主要来源为TAG 56:7（137.14 mg/L）、TAG 56:8（59.49 mg/L）、TAG 58:8（65.90 mg/L）和TAG 58:9（49.99 mg/L），PE是极性脂质中AA和DHA的重要来源[42]。西藏母乳脂质分析表明[41]，TAG、SM、PC和PE含量分别为对比母乳的85.84%、17.79%、25.94%和55.81%（北京、浏阳、洛阳和唐山）。
国家母婴乳品中心[72]基于气质的脂肪酸研究发现，不同泌乳期中国母亲母乳中的饱和脂肪酸（Saturated fatty acid，SFA）含量在初乳和成熟乳中差异显著。多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）的含量在泌乳期间无明显差异，AA和DHA含量会随着泌乳期的延长而逐渐降低，在初乳、过渡乳中的含量均显著高于成熟乳。并且发现中国母乳中主要含有10种Sn-2脂肪酸[46]，其中，以棕榈酸（C16:0，54.42%）、油酸（C18:1n-9，14.95%）、亚油酸（LA，C18:2n-6，12.81%）、肉豆蔻酸（C14:0，4.50%）和C12:0（3.17%）为主。
2.2 糖组学
依据母乳中2'-岩藻糖基乳糖（2'-Fucosyllactose, 2'-FL）、乳-N-岩藻糖基五糖I（Lacto-N-fucopentaose I，LNFP I）和乳-N-岩藻糖基五糖II（Lacto-N-fucopentaose II，LNFP II）的游离低聚糖结构特点，可将母乳分为4个类型：分泌型阳性、分泌型阴性、非分泌型阳性和非分泌性阴性[73]。此外，由于全球未有统一的标准检测方法，不同实验室检测的数据可能存在一定的误差。在过去的25年中，为深入了解不同人群中母乳低聚糖的变化差异，已经进行了多项研究。
陈历俊等[50]以15种HMOs为标准品，分析了初乳、过渡乳和成熟乳中游离低聚糖含量，揭示了中国母乳的低聚糖特点，结果发现分泌型阳性母乳占比最高，为77.8%；非分泌型阳性母乳占比11.1%；分泌型阴性和非分泌性阴性数量较少，分别占比5.6%；分泌型母乳占83.3%，非分泌型母乳占16.7%。母乳低聚糖在总体上呈现出随泌乳时间下降的趋势。但3-岩藻糖基乳糖（3-Fucosyllactose，3-FL）随泌乳时间延长而增加，而6'-SL、乳糖-N-四糖（Lacto-N-Tetraose，LNT）随泌乳时间呈现先增加后下降的趋势。发现2'-FL、LNFPI是分泌型、非分泌型母乳差异最大的两种低聚糖。Mcguire等[74]采集了11个国际队列的410名健康女性的母乳，结果发现秘鲁人群母亲分泌型占比最高，占98%。肯尼亚、加纳、埃塞俄比亚（城市）、埃塞俄比亚（农村）、冈比亚（城市）、冈比亚（农村）、瑞典、西班牙、美国（加州）和美国（华盛顿洲）的母亲分泌型占比分别为81%、68%、78%、65%、85%、65%、79%、76%、95%和76%。通常Se基因编码的α-1-2-岩藻糖基转移酶（Fucosyltransferase 2，FUT 2）在某些地理区域比其他区域更为普遍[75]。天然母乳低聚糖混合物的不同组成和分布，反映了哺乳期女性的遗传基因特性（如：路易斯血型）、哺乳阶段、生活方式、饮食和生活地域等的不同，深入了解这些母乳低聚糖的组成与特性对研究婴幼儿营养非常重要。
早产儿母乳中唾液酸研究发现，与同期足月母亲的母乳相比，早产母亲的母乳在每个时间节点都含有更多的唾液酸，并且母乳中唾液酸的含量随着孕周的减少而增加；母亲年龄、孕前BMI和分娩方式对母乳中的总唾液酸有显著影响，尤其是对早产儿母乳[76]。
2.3 蛋白质组学
陈历俊团队比较了不同阶段、不同地域母乳的乳脂肪球膜蛋白共有1163种，不同地区之间差异的82种蛋白中，20.86%的蛋白参与细胞过程，18.71%的蛋白参与代谢过程，17.27%参与单生物过程，10.79%的蛋白参与细胞定位过程，还参与了生物调节、应激反应、单生物信号、免疫系统过程等；除此之外，这些差异蛋白39.58%具有粘合性，31.25%具有催化活性，20.83%具有结构分子活性，还有抗氧化活性、酶调节活性和分子换能活性。本方法鉴定出的乳脂肪球膜蛋白种类数显著高于文献报道中的17种[77]、7种[78]、191种[79]。
2.4 矿物质和维生素
基于中国母婴营养健康研究队列[18]，分析了母乳样本的矿物质含量，应用闷罐消解-电感耦合等离子体质谱法和动态反应池技术，分析了不同泌乳阶段母乳中10种矿物元素，发现随着泌乳期的延长，母乳中的矿物质元素的含量逐渐减小。
依托队列研究，选取中国3个较大城市（南北分布）的147对母婴，在332份母乳样本中测定了9种主要维生素，采用多元线性回归方法分析了母婴因素对母乳9种维生素含量变化的影响[19]，发现三种维生素（维生素A、β-胡萝卜素和泛酸）随哺乳期呈显著下降趋势（|r|>0.3，P<0.05），泌乳阶段可解释维生素A（21.2%）和泛酸（9.5%）随泌乳期显著降低的变化，哺乳期和油脂摄入因素可共同解释β-胡萝卜素变化（11.8%）。
2.5 益生菌
国家母婴研究中心通过对产后前6个月定期进行随访，采集3~5 d、13~15 d、1个月、4个月、6个月的母乳样本，进行16S rRNA高通量测序，揭示了不同的泌乳阶段、城市、饮食习惯等对产后前6个月母乳微生物的影响。结果在属水平共发现了293种微生物，分娩后3~5 d与其他阶段有显著差异；随着泌乳期延长，葡萄球菌属（Staphylococcus）和孪生球菌属（Gemella）的丰度显著下降，假单胞菌属（Pseudomonas）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）的丰度增加[7]。进一步基于Bray-Curtis距离进行Adonis组间分析表明，不同城市母乳样本富集不同菌群[7]：唐山地区母乳主要是变形菌门（Proteobacteria）、变形菌纲（Gammaproteobacteria）和不动杆菌属（Acine-tobacter）为主，北京地区母乳主要是伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）为主，浏阳地区母乳主要是厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）、链球菌属（Streptococcus）和罗氏菌属（Rothia）等为主，而洛阳地区母乳主要是变形菌门、拟杆菌目（Bacteroidales）为主。Liu等[7]分娩后前6个月的目标个体定期随访，通过食物频率问卷（Food Frequency Questionnaire，FFQ）评估以及相关性分析，探究哺乳期饮食习惯与母乳微生物的关系，结果表明食用块茎类食物与奈瑟菌属（Neisseria）和痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium）丰度增加显著相关；碳水化合物或者锰元素的摄入与湖水中水杆状菌（Aquabacterium）丰度增加显著相关；维生素B12的补充与粪球菌（Coprococcus）丰度增加显著相关；钙的补充与罗氏甲基杆菌（Methylorubrum）丰度增加显著相关；食用鱼类与温单胞菌（Tepidimonas）丰度增加显著相关。
Moossavi等[80]通过16S rRNA测序和宏基因组检测母乳发现了近百种微生物，母乳细菌的构成受多种因素的影响。母乳中丰度较高的菌属主要含有链球菌（Streptococcus）、葡萄球菌 （Staphylococcus）和肠球菌属（Enterococcus）。乳酸杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）在部分母乳中能够检测到，相对丰度较低，一般小于1%[81]。
陈历俊团队筛选分离了40多株母乳源益生菌，其中包括了植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarun）、格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）、罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）和鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）等。其中10株益生菌搭载神州飞船到太空进行了太空育种，后续相关的研究正在进行中。通过体外实验证明，母乳源的候选益生菌中，有4株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarun）和1株格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）具有良好的移植血管紧张素转换酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）的能力，表明其有良好的降低血压潜力[82]。体外实验还证明，母乳源格氏乳杆菌 B1-26 （Lactobacillus gasseri B1-26）、B1-29 （Lactobacillus gasseri B1-29）以及母乳源罗伊氏粘液乳杆菌 B1-27 （Limosilactobacillus reuteri B1-27）和B1-28（Limosilactobacillus reuteri B1-28）有较高的胆固醇降解率[82]，以及良好的潜在降血脂的能力；陈历俊等[83]通过体外实验发现母乳来源的罗伊氏粘液乳杆菌B1-10（Limosilactobacillus reuteri B1-10）、罗伊氏粘液乳杆菌B1-27（Limosilactobacillus reuteri B1-27）及格氏乳杆菌B1-26（Lactobacillus gasseri B1-26）能有效降解鸟苷和肌苷；叶酸是一种人体所必需的微量维生素[84]，利用培养基优化和代谢途径研究等方法筛选出一株母乳源高产叶酸的菌株-罗伊氏粘液乳杆菌B1-28（Limosilactobacillus reuteri B1-28），并通过基因编辑技术敲除了叶酸的负调控基因，使叶酸的产量明显的提升，具有较好的市场应用价值。
2.6 细胞和外泌体
研究发现母乳中含有至少10种细胞，包括成纤维细胞群、2种上皮细胞和7种免疫细胞[9]。美国的Biomilq、108Labs和新加坡企业Turtle Tree都在加速研发细胞培育乳。目前，国家母婴研究中心通过细胞分离和培养技术，从母乳中分离了干细胞和乳腺上皮细胞等，以建立泌乳细胞库，并将通过组学等手段研究比较不同阶段、不同生理状态下泌乳细胞的组成和功能变化，筛选出影响泌乳的关键调控因子和通路；最终在体外诱导泌乳细胞分泌乳成分，分离获得结构和功能更接近人乳的功能配料，为模拟更接近自然母乳的婴幼儿奶粉配方粉提供新的原料和思路。
国内外关于母乳外泌体的组学研究还尚不完善，为弥补此方面不足，陈历俊团队开展了母乳内外泌体的组学探究工作。初步结果表明[70]，不同地区和不同阶段的母乳内外泌体的蛋白质组均存在显著差异。北京和西藏地区母乳外泌体分别有603种、1036种，两地区共有279种蛋白质，其中有42种蛋白质在丰度上存在差异。初乳、过渡乳、1月成熟乳、4月成熟乳外泌体蛋白质分别有610种、537种、602种、583种，不同阶段共有195种，其中有29种蛋白质在表达上存在差异。母乳外泌体的脂质和RNA组学研究在进行中。
2.7 母乳组学数据库的建立
国家母婴研究中心完成了母乳脂质组、糖组、蛋白质组、矿物质、维生素、益生菌、细胞和外泌体等检测。发现初乳或/和过渡乳中多数成分含量显著高于成熟乳，包括蛋白（乳脂肪球膜蛋白、乳铁蛋白、α-乳白蛋白、β-酪蛋白等）、脂质（磷脂酰胆碱、神经酰胺Sn-2位棕榈酸等）、糖（3'-唾液酸乳糖等低聚糖、不同结合形式唾液酸等）、矿物质（锌等）；初乳总能量显著低于成熟乳，主要由于初乳中脂肪、糖类、总酪蛋白含量显著低于成熟乳；不同地域母乳代谢物、蛋白、脂质、糖、维生素差异显著，为母婴精准营养研究奠定了科学基础。
该中心还创建了覆盖宏量与微量营养素、功能组分、微生物等3631种组分、560万个数据的中国健康母乳成分数据库，可实现不同区域、不同泌乳阶段、不同分娩方式、不同性别等维度的查询，引领了中国健康母乳研究。
3. 中国母乳组学模拟
婴配粉的持续创制，是在明确主要基料牛乳等与母乳组学差异的基础上，不断将中国母乳组学队列研究的最新成果，转化到婴配粉的创制中；从模拟母乳组成的程度上来看，将是多种成分的科学配比方面的提升，而不再是单一成分的调整，更有助于提升婴儿食品配方的科学合理性。
3.1 牛乳组学研究
陈历俊等[20]采用了UPLC-Q-TOF-MS方法对牛乳和母乳的脂质组成进行了全面解析，牛乳中鉴定到的脂质种类总数249种，低于母乳484种，包括TAG和主要磷脂（PE、PC和SM）的种类数也低于母乳；与牛乳相比，母乳中总磷脂和总甘油三酯的浓度更高；在母乳中，短链和中链脂肪酸主要在TAG的Sn-3位置发生酯化，这与牛乳中的酯化过程一致[85]；不同哺乳动物乳汁中牛乳中的总磷脂的浓度最接近母乳[3]。
与母乳相比，牛乳中的低聚糖含量较低，但结构具有多样性。研究对比了HMOs和牛乳低聚糖的结构[21]，发现牛乳中至少存在15种与HMOs结构相同并检测了其中主要的9种HMOs，其中脱脂乳微滤渗透液、复原脱盐乳清粉、甜乳清和加热乳清中总低聚糖浓度分别为0.10、0.10、0.12和0.12 g/L。该牛乳低聚糖浓度结果与Quinn等[86]报道的相一致，为HMOs的模拟奠定了理论基础。
陈历俊等[6]通过anoLC-Orbitrap MS技术分析牛乳与母乳中的乳脂肪球膜蛋白的差异表明，在母乳和牛乳中检测到共有175种蛋白。将母乳中差异表达的蛋白质按PANTHER数据库进行蛋白质的Gene Ontology（GO）功能注释，这些蛋白主要是细胞部分、细胞器、细胞膜等组分，参与的生物途径有新陈代谢等[6]。
3.2 中国母乳组学模拟
基于中国母乳组学分析，根据牛乳与母乳中组学分析的差异，结合管理与技术创新，建立了基于风险分析的全产业链标准化的质量安全管理体系，确保了母婴乳品质量安全。创制了科学配比MFGM（关键成分包括乳粘蛋白、唾液酸和磷脂等）、OPO、低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）和低聚果糖（Fructooligosaccharide，FOS）的新型婴幼儿配方粉。并通过创新建立的脂质组、糖组、蛋白质组等检测技术，综合评价了婴幼儿配方食品模拟母乳的水平。
陈历俊等[20]对比分析了六类不同乳基（牛乳基、羊乳基和豆基）、不同磷脂补充剂（未添加、添加MFGM或大豆磷脂）的婴幼儿配方奶粉和中国母亲母乳中的极性脂（Polar lipids，PLs）含量发现，结果表明婴幼儿配方奶粉中总PLs和总TAGs的浓度显著低于母乳；母乳中PE、SM和PC是含量最高的主要极性脂，在奶粉中PE（15.81 mg/L）和SM（35.84 mg/L）含量也均显著低于母乳（分别为30.74、45.53 mg/L）；在六类婴配粉中，牛乳基婴配粉中的PLs种类最多，添加MFGM的婴配粉中PLs含量最高，母乳中磷脂种类总数（231）高于各种婴配粉磷脂种类总数（159），相同的磷脂种类有133种，占母乳磷脂种类总数的57.58%。国家母婴研究中心升级后的新型配方粉与母乳共有的脂质240种（图1d），占母乳脂质的20.64%，其中，甘油磷脂与母乳共有97种，占母乳甘油磷脂种类的59.15%，鞘脂与母乳共有44种，占母乳鞘脂的54.32%；TAG 52:2和TAG 52:3的相对含量显著高于其他配方的均值（P<0.05）（图1a），PE、SM和总PLs含量也显著高于其他配方均值（图1b）。根据婴幼儿配方奶粉和母乳甘油酯相似度的模拟评分方法[87]，分析表明新型婴幼儿配方粉（1段）的甘油酯的评分为46.94，高于其他配方的评分均值30.67。
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图 1 新型婴幼儿配方粉与其他品牌配方粉（1段）成分的组学分析注：a.基于甘油酯的相对含量比较；b.磷脂含量比较；c.低聚糖含量比较；d.脂质种类数；e.低聚糖种类数；f.乳脂肪球膜蛋白种类数。Figure 1. Multiomics analysis of ingredients of new infant formula powder and other brand formula powder （stage 1）新型配方粉3-FL、3'-GOS、4'-GOS 6'-GOS、3'-SL和6'-SL的含量均高于其他配方均值，其中3'-GOS、4'-GOS、6'-GOS、6'-SL的差异显著。相较于其他配方，新型配方粉增加了低聚糖的总含量，更接近于母乳低聚糖水平（10150.60 ± 21.92 mg/kg）（图1c）。此外，新型配方粉的低聚糖种类（73种）高于其他配方均值（46种），与母乳相同的低聚糖种类数最多（61种），模拟了母乳中低聚糖种类的19.93%（图1e）。新型配方粉中定性到的乳脂肪球膜蛋白的种类数（201种）高于其他配方均值（181种），与母乳相同的种类数为178种（图1f），模拟了母乳脂质种类的15.31%[21,87]。新配方同时模拟了13种维生素、12种矿物质元素。同时，陈历俊团队基于早产儿母乳唾液酸的特征，模拟了母乳中富含唾液酸的乳脂肪球膜蛋白和糖蛋白等组成，创制了富含唾液酸的早产儿新配方[88]。
针对孕产妇便秘、糖尿病和早产等发病率分别为40%、18.9%、5%~14%的较高现状，基于母乳益生菌和低聚糖研究，研制了富含1种母乳源益生菌(格氏乳杆菌)、6种调节肠道健康益生菌（嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌和长双歧杆菌）、6种膳食纤维（低聚果糖、菊粉、聚葡萄糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖和低聚木糖）的发酵乳[89]。结合孕产妇对产品的多样化需求，同时创制了富含具有抑制有害菌定植、促进肠道微生态健康、提高免疫和缓解产后抑郁的益生菌和益生元孕产妇奶粉[90]。
4. 中国母婴乳品功效的组学评价
母婴食品配方是否更合理，不仅要体现在组学组成上模拟母乳营养组分，更重要地是通过动物模型评价和临床队列的循证；不仅要通过常见的体格发育、舒适度、健康状况等指标评价，更需要采用组学方法明确对肠道健康、免疫、代谢等母婴体内状况的影响，以判断是否有助于远期健康。
4.1 动物模型评价
MFGM是母乳中重要成分，含5类生物活性脂与乳汁中90%的蛋白种类，被称为婴幼儿配方奶粉中的“奶黄金”，具有促进大脑发育、增强免疫力和改善胃肠道健康的作用。
国家母婴研究中心与合作单位[25]通过建立新生仔猪模型，探究科学配比的功能配料（GOS+MFGM+FOS，GMF）的健康功效。结果表明哺乳早期仔猪灌服功能配料GMF，显著提高21日龄仔猪肠道微生物α-多样性指数 Sobs和 Shannon；显著增加与肠道屏障指标呈显著正相关的norank_f_Muribaculaceae、Enterococcus、Christensenellaceae_R-7_group 和 Romboutsia；显著增加回肠中丙酸和结肠中乙酸含量；显著上调回肠黏膜中耦联受体（GPR）基因 GPR41 以及结肠黏膜中 GPR41 和 GPR43 的 mRNA相对表达量；显著上调回肠黏膜中紧密连接蛋白（E-cadherin 和 ZO-1）、粘蛋白（Mucin-1、 Mucin-2 和 Mucin-4）和细胞因子（IL-22）的mRNA相对表达量；显著上调结肠黏膜中紧密连接蛋白（Occludin、Claudin-1和 ZO-1）、粘蛋白（Mucin-20）和细胞因子（TNF-α 和 IL-1β） 的 mRNA 相对表达量；显著降低血浆二胺氧化酶（DAO）活性。综上，科学配比的功能配料（GOS+MFGM+FOS）可促进有益菌定植（Lactobacillus），增加肠道短链脂肪酸含量，并提高肠道紧密连接蛋白（ZO-1）、粘蛋白（Mucin-2）和免疫细胞因子（ IL-22）表达，改善肠道屏障功能，进而提高仔猪的生长性能。
陈历俊团队[27]以哺乳仔猪为模型，研究乳脂球膜（MFGM）干预0~21 d仔猪的作用功效，发现与对照组比较，哺乳仔猪灌服MFGM显著提高14、21 d平均体重和平均日增重；显著降低载脂蛋白B1（ApoB1）水平；显著提高十二指肠、回肠绒毛高度、十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值，降低十二指肠隐窝深度；显著提高回肠紧密连接蛋白cadherin、claudin-4和黏蛋白mucin-13、mucin-20表达量；显著提高回肠IL-22、TLR2和结肠IL-22表达量；显著增加7 d时Fournierella、Eisenbergiella丰度，降低norank_f_Muribacuiaceae丰度；显著增加21 d Christensenellaceae_R7_Group、Rominococcaceae_UCG-005、Desulfovibrio丰度，降低Tyzzerella、Clostridium_sensu_stricto_2丰度。综上，乳脂球膜改善了仔猪生长性能、免疫调节、肠道屏障、肠道菌群，为乳脂球膜应用于配方奶粉，改善婴儿肠道健康提供理论依据。
通过便秘动物模型，研究了富含益生菌和膳食纤维的发酵乳改善便秘的功效与机制。结果发现，与健康对照组相比，便秘小鼠的肠道微生物组不同；酸奶干预显著缓解了便秘相关症状，并导致微生物组发生变化。酸奶还缓解了抗生素引起的小鼠便秘症状，并在一定程度上恢复了肠道微生物组[91]。
4.2 临床队列循证
通过MINC队列多点多中心、前瞻性0~6岁的队列研究，全面解析了新型配方对婴儿近远期健康的功效，其中0~6月龄599例婴幼儿研究队列，阐明膳食营养对婴儿生长发育和健康状况影响，构建了以婴儿体格发育、舒适度、患病率、肠道菌群、代谢物和免疫因子等为评价指标的喂养方式综合评价体系。
WAZ可用作儿童生长的动态监测指标[23]，BAZ值可综合评价婴儿整体营养和健康状况，结果表明3月龄后的WAZ值、6月龄时的变化值△WAZ、除3月龄外的BAZ值、6月龄时骨密度在新型婴配粉组与母乳喂养组间无显著差异，3月龄时新型婴配粉组组婴儿BAZ值显著高于母乳组婴儿。因此，新型配方粉能保持婴儿整体营养和健康状况与母乳喂养婴儿无显著差异。舒适度评价结果显示[23]，配方乳粉喂养婴儿呛奶、严重回奶、呕吐、不良情绪现象发生频率与母乳喂养婴儿一致，表明新型配方对于正处于发育期的婴儿脆弱的肠道舒适度更接近于母乳喂养婴儿。免疫系统发育是婴幼儿健康成长的重要指标[23]，研究通过两周患病率比较发现，0~6个月内疾病（患呼吸道、消化道、皮肤类疾病）的发生率、1~6月龄粪便中sIgA含量与母乳喂养婴儿无显著差异。
肠道微生物组分析表明，双歧杆菌科Bifidobacteriaceae在0~6月龄婴儿肠道中的相对丰度[23]、婴儿肠道菌群主要门水平组成（厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门）与母乳喂养婴儿无显著差异[22]；体外实验确证MFGM关键成分乳凝集素、唾液酸和磷脂的组合可促进婴儿粪便双歧杆菌生长、抑制有害菌增殖[26]。尿液代谢组分析表明，在1月龄时，77种代谢物中71种与母乳喂养婴儿无显著差异[26]。
通过持续跟踪MINC队列，通过采集5~6岁时体格发育、神经心理和智力、健康状况、生理生化指标、肠道菌群、尿液代谢物等指标，结果表明0~6月采用功能配料科学配比的配方喂养的婴儿肠道菌、体格发育、社交能力、总胆红素、补体C4等与母乳组无显著差异。
极早产儿（Very preterm，VPT）队列28 d的干预发现，含有特定益生元混合物scGOS/lcFOS（9:1）和糖肽（Casein glycomacropeptide，GMP）的早产儿配方粉干预4周后，与对照组相比，试验组中双歧杆菌的丰度显著增加；KEGG功能分析表明，肠道和大脑模块和四种肠道代谢模块在试验组中均显著富集；说明富含scGOS/lcFOS（9:1）和GPM的配方奶粉有利于VPT婴儿的肠道微生态。
超重/肥胖孕妇队列研究表明，富含益生菌、膳食纤维发酵乳干预孕早期到分娩后孕妇，可有效预防孕期便秘，显著降低妊娠期糖尿病和早产；并发现发酵乳干预显著降低产后 42 d 母乳中韦荣氏球菌属、痤疮丙酸杆菌属、链球菌属、罗斯氏菌属和奈瑟氏菌属等菌属的相对丰度，显著提高罗尔斯通菌属的相对丰度，并显著增加产后 3~6 个月母乳中真蛋白含量[92]。
5. 结论
本文通过创新建立母乳脂质组、糖组、蛋白质组、微生物组等组学研究技术，解析中国代表性区域母乳组学3631种组分的特征及变化规律，对比牛乳与母乳的差异，创制了添加科学配比功能配料的新型配方粉，并通过组学评价揭示了其脂质组、糖组、蛋白质组的组成与其他配方相比更接近中国母乳，模拟了504种母乳组分，动物模型评价和临床队列循证证明其具有促进有益菌定植、增加肠道菌群多样性、增加肠道短链脂肪酸含量、改善肠道屏障的功能，实现了组成与喂养效果更接近母乳的新型婴配粉的产业化创制。系统全面的母乳组学研究是推广母乳喂养、提高母乳质量、提升婴幼儿食品配方的必要前提。未来需持续基于前沿分析技术，创新完善母乳分子组成、结构的检测方法；持续开展不同饮食、环境下的中国母婴营养队列研究，通过组学技术揭示中国母乳组成与影响因素，明确影响婴幼儿近远期健康的主要组分及协同作用；持续用科学数据推广母乳喂养，为哺乳妈妈提出提升母乳质量的合理化建议，创制组学组成与喂养效果全面更接近母乳的婴幼儿配方食品，任重而道远。
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