A Comparative Study on Physicochemical Indices and Fungal Community Composition of Medium-temperature and High-temperature Daqus from the Same Region
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摘要: 为减少季节、地域等因素的干扰，探究不同顶温控制策略对大曲真菌群落的影响，本研究主要运用高通量测序技术对采集自同一优质白酒核心产区的中温及高温大曲的真菌群落进行了解析与比较，并结合冗余分析评估了大曲真菌群落与主要理化指标间的相关性。结果表明，高温大曲整体真菌数量（由ITS1区rDNA拷贝数表征）少于中温大曲，但前者中的真菌群落在丰富度、多样性、均匀度上整体高于后者。嗜热子囊菌属（Thermoascus）、毕赤酵母菌属（Pichia）、曲霉菌属（Aspergillus）、根霉菌属（Rhizopus）在中温大曲中占比更高，其中以橙色嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）为绝对优势菌；嗜热丝孢菌属（Thermomyces）、埃默森罗萨氏菌属（Rasamsonia）、红曲霉菌属（Monascus）、丝衣霉菌属（Byssochlamys）在高温大曲中占比更高，其中以疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）为绝对优势菌。根据随机森林预测模型，最能解释两类大曲菌群差异的前十个关键ASV分别归属于坚脆嗜热子囊菌（Thermoascus crustaceus）（5个）、Thermomyces spp.（4个）、Thermoascus aurantiacus（1个）三大类群。冗余分析结果显示，在两类大曲中，Aspergillus、Rasamsonia、生丝毕赤酵母属（Hyphopichia）均与糖化力呈正相关，Pichia均与酸度呈强正相关，Thermoascus均与水分呈现强正相关。本研究进一步明确了不同发酵顶温大曲的真菌群落多样性及标志物种，另探究了大曲真菌群落与主要理化指标的相关性，为制曲工艺优化和功能菌株筛选提供了参考。Abstract: In order to reduce the interference of seasonal, geographical and other factors and explore the effect of different peak-temperature control strategies on the fungal community of Daqu, this study mainly applied the high-throughput sequencing technology to analyze and compare the fungal community in medium-temperature and high-temperature Daqus collected from the same core production region of high-quality Baijiu. The correlation between the fungal community in Daqu and the main physicochemical indices was also evaluated by combining redundancy analysis. The results showed that the overall population of fungi (characterized by the copy numbers of ITS1 region of rDNA) in high-temperature Daqu was smaller than that in medium-temperature Daqu, but the richness, diversity, and evenness of overall fungal community in the former were higher than that in the latter. Thermoascus, Pichia, Aspergillus and Rhizopus accounted for a higher proportion in medium-temperature Daqu, with Thermoascus aurantiacus as the absolute advantage. Thermomyces, Rasamsonia, Monascus, and Byssochlamys accounted for a higher proportion in high-temperature Daqu, with Thermomyces lanuginosus as the absolute advantage. Based on the random forest prediction model, the first ten key ASVs that could best explain the differences between the two Daqu communities belonged respectively to three major groups including Thermoascus crustaceus (for 5 ASVs), Thermomyces spp. (for 4 ASVs), and Thermoascus aurantiacus (for 1 ASV). The results of redundancy analysis showed that Aspergillus, Rasamsonia and Hyphopichia in two types of Daqu had a positive correlation with saccharifying power, Pichia had a strong positive correlation with acidity, and Thermoascus had a strong positive correlation with moisture. This study further clarified the diversity of fungal community and biomarkers in Daqus with different peak-temperatures, explored the correlation between the fungal community in Daqu and the main physicochemical indices, and provided a reference for the optimization of Daqu making process and the screening of functional strains.
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Keywords:
- amplicon sequencing /
- Daqu /
- fungal diversity /
- temperature /
- redundancy analysis
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中国白酒风格独特、文化内涵丰富、群众基础牢固，经过上千年的积淀与发展，至今仍历久弥新。白酒种类繁多，常见香型包括浓、清、酱、米、兼等[1]，其中以浓、酱香型最受广大消费者的青睐，市场份额常年稳居前二。这两类主流白酒均经固态发酵酿制而成，但在各个工艺环节上均存在较大差异，中温大曲（发酵过程顶温50~60 ℃）和高温大曲（发酵过程顶温60~70 ℃）分别作为浓香型白酒和酱香型白酒的糖化发酵剂，对这两类白酒品质和风格形成具有重要影响[2]。
大曲是集菌系、酶系及物系为一体的重要载体，不同的顶温控制策略使成品曲的理化指标、风味物质、微生物群落等各不相同[3]。研究不同顶温大曲的微生物组成及差异，对白酒发酵机制研究及酿造微生物资源开发具有重要意义。Ban等[4]采用扩增子测序和宏蛋白质组学技术，对一批发酵顶温为35 ℃的酒曲样品进行真菌群落解析，发现Wickerhaomyces、Saccharomysis、Aspergillus和Saccharomyces是此类酒曲的核心类群，并基于高斯过程回归和线性回归建立了通过发酵过程参数对核心菌群的预测模型。杨少勇等[5]对襄阳市某酒厂的高温大曲和中温大曲真菌群落结构进行解析，发现高温大曲真菌类群以Thermomyces和Thermoascus为主，而中温大曲真菌类群以Thermomyces、Thermoascus和Aspergillus为主。冯佳婷等[6]以同一批制曲原料分别进行中温和高温发酵，发现Thermoascus同为高温大曲和中温大曲中的高丰度菌属，而Aspergillus在高温大曲中的平均相对丰度比中温大曲中高出三倍以上，且高温大曲的液化酶和糖化酶显著低于中温大曲。Kang等[7]从国内不同区域采集了高温、中温、低温三类大曲，采用扩增子测序解析其微生物群落结构，发现中温大曲优势真菌以Saccharomycopsis和Aspergillus为主，高温大曲优势真菌以Byssochlamys和Saccharomycopsis为主。
到目前为止，对不同顶温类型的大曲研究仍多存在平行采样个数较少、采样来源单一等问题，且在已有报道中，针对发酵温度与菌群间相关性的研究很容易受到地域、季节等因素的干扰。据此，本研究主要采用高通量测序技术，以来自同一地区不同厂家的中温大曲和高温大曲为研究对象，对两类大曲在真菌群落组成和多样性上的差异进行了更为系统地探究，并结合冗余分析评估了大曲真菌群落与主要理化指标间的相关性，旨在为大曲的生产和研究提供借鉴。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
中温及高温大曲 均由产自河南的软质小麦（Triticum aestivum）发酵制成，从制曲起始至最终进行样品采集的时间均为三个月；土壤DNA提取试剂盒 美国Omega公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（2×） 南京诺唯赞生物科技股份有限公司；葡萄糖、琼脂糖、可溶性淀粉 生工生物工程（上海）股份有限公司；氢氧化钠、盐酸、次甲基蓝、碘、碘化钾、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、乙酸、乙酸钠 泸州聚合化工有限公司。
DHG-9245A电热鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；TIB8600实时荧光定量PCR仪 泰普生物科学（中国）有限公司；ME20A电子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；Sub System 70电泳槽 美国Labnet公司；Mini-300电泳仪 美国Major Science公司；NanoDrop2000微量紫外可见分光光度计 美国Thermo Scientific公司；Seven Excellence多参数测试仪 瑞士Mettler-Toledo公司；MLS-3751L-PC高压蒸汽灭菌锅 日本Sanyo公司；5804R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；TL2010S中通量组织研磨破碎仪 鼎浩源科技发展（天津）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品采集
四组样品分别采集自中国西南部赤水流域（优质白酒生产核心区域）两家中温大曲及两家高温大曲生产企业，于每家企业随机采集六块符合正常发酵感官特点的同批次大曲。其中，两组中温大曲发酵过程顶温均在55 ℃左右，分别标记为MT-A、MT-B组；两组高温大曲发酵过程顶温均在65 ℃左右，分别标记为HT-A、HT-B组。另按“分组-序号”为所有样品进行一一标注。将每块大曲粉碎均匀后的适量样品分别置入无菌袋中，24份样品于−80 ℃低温冷冻保藏备用。
1.2.2 理化指标的检测
样品水分、粗淀粉、总酸、还原糖、糖化力等理化指标参照轻工业行业标准QB/T 4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》进行测定。
1.2.3 大曲基因组提取
以组织研磨破碎仪结合液氮冷冻操作对适量样品进行前处理，采用试剂盒提取样品总DNA，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并通过微量分光光度计测定OD260/OD280比值判断DNA是否存在RNA和蛋白质污染。
1.2.4 荧光定量PCR
以质检合格后的大曲总DNA为模板，利用荧光定量PCR方法对大曲真菌进行绝对定量，所采用的引物为ITS1f（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和5.8s（5’-CGCTGCGTTCTTCATCG-3’）[8]。反应体系如下：DNA模板1 µL，ddH2O 7 µL，Mixure A 8 µL（按表1配制）。反应程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。采用已知浓度的标准品制作标准曲线，对未知浓度的样本进行拷贝数的测定。
表 1 Mixture A体系组成Table 1. Composition of Mixture A试剂 体积（µL） AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（2×） 10 10 μmol/L的PCR正向引物ITS1f 0.4 10 μmol/L的PCR反向引物5.8s 0.4 1.2.5 扩增子测序
将质检合格后的DNA样品送至上海派森诺生物科技有限公司完成ITS1区域目的片段扩增及测序。正向引物为ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’），反向引物为ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）[9]。
1.3 数据处理
基于QIIME 2软件DADA2流程对原始序列进行质控，经去重（类似以100%相似度进行聚类）得到扩增子序列变异（Amplicon sequence variants，ASVs）序列及表格，使用UNITE 8数据库对ASVs进行分类学注释。利用派森诺云平台（https://www.genescloud.cn）完成群落多样性分析及基于非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的聚类分析。采用联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn）完成随机森林分析及冗余分析（Redundancy analysis，RDA），采用STAMP 2.1.3软件完成主要物种丰度的组间差异分析，采用SPSS 26软件对理化指标进行单因素方差分析。
2. 结果与分析
2.1 不同顶温类型大曲的理化指标分析
大曲各项理化指标如图1所示，中温大曲（MT组）和高温大曲（HT组）在水分、粗淀粉、还原糖、总酸含量以及糖化力上均表现出显著性差异（P<0.05），其中，前四种指标的平均数值在两类大曲间较为接近，而糖化力的平均数值则相差两倍以上。
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图 1 不同分组大曲样品理化指标注：图A、B、C标注的不同字母代表同一指标不同组别数值间存在显著性差异（P<0.05）；图D、E、F标注的*代表同一指标不同组别数值间存在显著性差异（P<0.05），**代表数值间存在极显著性差异（P<0.01）。Figure 1. Physicochemical indices of Daqus of different groups通过图1A和图1D、图1B和图1E的进一步对比发现，前四种指标之所以在MT和HT样品大类间呈现出显著性差异，主要原因在于某一小组指标数值与其它三组样品存在明显差距，具体表现为：MT-A组平均水分含量为12.05 g/100 g样品，平均还原糖含量为1.08 g/100 g绝干样品，两项指标在数值上均明显低于其它三组；HT-A组绝干样品中的平均粗淀粉和总酸含量分别为69.90 g/100 g和1.20 mmol/10 g，显著区别于其它三组（P<0.05）。大曲中的水分含量主要受到曲房温度、湿度以及微生物生长的影响；总酸含量是微生物代谢过程中氧化分解脂肪、淀粉、蛋白质生成酸类物质的总和，能够在一定程度上表征大曲发酵中微生物的生长代谢情况[10]；粗淀粉和还原糖含量则用于表征大曲微生物对淀粉和游离单糖的利用情况。因此，总的来说，这四种理化指标在样品中并未按照两大发酵顶温类型呈现出明显分化，这意味着两类大曲中微生物整体代谢情况及对淀粉类底物的整体降解程度较为近似。
大曲中的糖化酶能够将原料中的淀粉进行水解，其活力也能够在一定程度上反映出大曲中的淀粉利用率。虽然粗淀粉测量结果提示高温大曲中的淀粉利用率整体接近甚至略高于中温大曲，但糖化力的比较分析结果却显示高温大曲在37 ℃下表现出的糖化力（在绝干样品中的平均值分别为296.65 U/g和182.38 U/g）显著低于中温大曲（在绝干样品中的平均值分别为615.57 U/g和823.12 U/g），后一发现也与前人研究结果吻合[6, 11]。糖化力与大曲中微生物的生长、繁殖、代谢直接相关，尤其是霉菌，其中根霉[12]、曲霉[13]对大曲糖化力影响较大。粗淀粉含量与糖化力数据产生矛盾的原因可能在于：一方面，原料本身的淀粉含量可能存在一定差异；另一方面，虽然微生物分泌的糖化酶能够累积在大曲中，但随着大曲水分的不断散失，干燥生境也许无法提供使酶发挥催化活性的客观条件[14]，导致淀粉消耗较快出现停滞，因而在其利用率上未能拉开明显差距。不过正因如此，这些留存在大曲中的糖化酶具有有效促进白酒发酵体系中淀粉糖化的潜力，即在大曲被投料至湿润的高粱原料后，为酵母分解葡萄糖生成乙醇等小分子物质提供充足的前体物质。因此，中温大曲相较于等量的高温大曲来说，能更有效地促进淀粉的糖化过程，从而快速启动糟醅发酵。
2.2 不同顶温类型大曲的真菌群落定量分析
通过荧光定量PCR得到同一基因片段在不同样品中的拷贝数，可对真菌群落整体数量进行评估，结果如表2所示。大曲整体真菌数量随着大曲发酵顶温的升高而有所减少，这一结果与方程等[15]的研究结果一致，表明过高的发酵温度可能会限制大曲生境内真菌类群的繁殖与累积。
表 2 不同分组大曲样品真菌定量结果Table 2. Quantification of fungi in Daqus of different groups分组 基因拷贝数（/g干重） MT-A （3.838±0.969）×109 a MT-B （2.277±0.992）×109 a HT-A （1.862±0.445）×109 ab HT-B （3.420±1.545）×108 b 注：同列不同字母代表数值间存在差异性显著（P<0.05）。 2.3 不同顶温类型大曲的真菌群落多样性及物种组成分析
2.3.1 真菌群落α-多样性分析
α-多样性指数可从多个角度表征样品真菌群落的复杂度，结果如图2所示。两类大曲真菌群落的Goods_coverage指数（即覆盖率）无显著性差异（P>0.05），均超过0.9990，这说明测序量合理，测序结果可以较好地反映被测大曲样品的真实情况[16]。此外，除了Simpson指数外，中温大曲真菌群落在其余α-多样性指数数值上均显著低于高温大曲（P<0.01），这一结果与前人报道有一定出入。在方程等[15]相关研究中，中温大曲真菌群落Observed_species指数高于中温大曲，Shannon指数低于高温大曲；杨少勇等[5]研究结果表明，襄阳地区高温大曲与中温大曲真菌群落的Observed_species指数及Shannon指数均无显著性差异（P>0.05）；李静心等[17]发现中温大曲真菌群落Observed_species指数略高于高温大曲，Shannon指数极显著高于高温大曲（P<0.01）。这些发现提示温度对真菌群落多样性指数未产生明显的特定影响。鉴于α-多样性指数仅能部分表征群落多样性概貌，后文将从多样性组成方面深入讨论温度对真菌群落结构的可能影响。
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图 2 中温大曲及高温大曲真菌群落常见α-多样性指数比较注：**代表数值间存在极显著差异（P<0.01）；***代表数值间存在高度显著差异（P<0.001）。Figure 2. Comparison of common α-diversity indices of fungal community in MT-Daqu and HT-Daqu除此之外，本研究通过DADA2模型算法对下机序列进行处理，这与过去研究中常用的基于97%相似性阈值聚类得到可操作分类单元（Operational taxonomic units，OTUs）数据集的方式有所不同，它可以通过概率模型纠正测序错误，并将去重复后得到的ASVs作为最小分类单元[18]，已被越来越多地用于食品、环境、临床等微生物组学的分析。因此，此方法所涉及的单元数种类会更加多元，同时影响微生物群落多样性、组成以及其与环境因子关联性分析[19]。相应地，基于这一种划分方式，本研究高温大曲中真菌群落在丰富度（由Observed_species指数、Chao1指数表征）、多样性（由Shannon指数表征）、均匀度（由Pielou_e指数表征）上整体高于中温大曲。
2.3.2 真菌群落物种组成及聚类分析
参考UNITE数据库对ASVs序列进行物种注释，可得到种水平上的物种组成及丰度信息，另外基于Bray-Curtis距离对各样品进行非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚类分析，结果如图3所示。
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图 3 中温大曲及高温大曲真菌群落组成及UPGMA聚类分析Figure 3. Composition and UPGMA cluster analysis of fungal community in MT-Daqu and HT-Daqu根据聚类信息，24份大曲可明显根据顶温类型聚为两大类，这说明中温大曲与高温大曲真菌区系间存在着显著差异。各中温大曲样品之间的距离相较高温大曲组的内部距离更远，即高温大曲样品真菌群落间的差异相对更小，原因可能是高温作为一种主要的环境压力，对真菌群落演替有着较强的驱动力，能够使得发酵顶温相似的样品拥有较为趋同的群落演替方向[8]。同一厂家来源的同类型大曲之间表现出较高的内部相似性，有一处例外是MT-A-1和MT-B-3的真菌群落结构彼此相似，但与其余中温大曲样品均存在一定差异，因此在层级聚类树上单独聚为一簇。
根据物种组成信息，中温大曲中的优势真菌主要包括橙色嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）、未知的毕赤酵母菌（unidentified Pichia）、赤曲霉（Aspergillus ruber）等，其中以Thermoascus aurantiacus为绝对优势菌。高温大曲中的优势真菌主要包括分类地位未知的嗜热丝孢菌属（unclassified Thermomyces）、Thermoascus aurantiacus、坚脆嗜热子囊菌（Thermoascus crustaceus）等丝状真菌，其中以unclassified Thermomyces为绝对优势菌，且少有酵母类真菌的分布。
2.4 不同顶温类型大曲的真菌群落物种差异分析
2.4.1 不同顶温类型大曲的主要真菌类群丰度差异分析
为探究造成两类大曲真菌群落结构整体差异的主要类群，对丰度排名较靠前的真菌（包括属水平及种水平的分类单元）进行了组间差异分析，以甄别群落中的关键真菌类群，结果如图4所示。
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图 4 中温大曲及高温大曲真菌群落主要类群的组间差异分析注：A：属水平；B：种水平。Figure 4. Inter-group differences of major taxa in fungal communities between MT-Daqu and HT-Daqu据图4A，嗜热子囊菌属（Thermoascus）、毕赤酵母菌属（Pichia）、曲霉菌属（Aspergillus）、根霉菌属（Rhizopus）在中温大曲真菌群落中占比更高；嗜热丝孢菌属（Thermomyces）、埃默森罗萨氏菌属（Rasamsonia）、红曲霉菌属（Monascus）、丝衣霉菌属（Byssochlamys）在高温大曲真菌群落中占比更高。
据图4B，种水平上的差异分析结果与属水平结果相呼应，在图4A所示的高温大曲标志菌属之中，有四个菌属在图4B中各自对应了一个主要物种，分别为Aspergillus ruber、Rasamsonia composticola、紫红曲霉（Monascus purpureus）、大观贝氏菌（Byssochlamys spectabilis）。Aspergillus ruber[20]、Monascus purpureus[21]、Byssochlamys spectabilis[22]均已通过培养手段从大曲中分离得到，嗜热新种Rasamsonia composticola于2013年首次从云南堆肥样品中分离得到，最适生长温度为45~50 ℃[23]，目前在大曲研究中仍鲜有报道。Thermoascus属下的两种真菌Thermoascus aurantiacus以及Thermoascus crustaceus虽然亲缘关系较近，但在两类大曲中呈现出相异的分布趋势。在中温大曲中有更高占比的Thermoascus aurantiacus被认为是一种能够促进生物质转变为生物燃料的潜力微生物资源，能够分泌多种纤维素酶及半纤维素酶，在未经培育或基因改造的情况下就已在降解木质纤维素上表现出优越性，且在50~60 ℃温度范围内，其培养液上清中的葡萄糖释放效率十分接近商业化多酶混合物（Enzyme cocktail）[24]。在高温大曲中有更高占比的Thermoascus crustaceus同样在基因工程及酶工程中展现出了较高的研究价值，研究者们已先后从此菌种挖掘到木聚糖酶/纤维素酶双功能酶[25]，β-葡糖苷酶[26]、阿魏酸酯酶[27]等多种耐热酶基因，这些酶的最适温度介于55~70 ℃之间，最适pH介于4.5~6.0之间，与高温大曲发酵至顶温时的生境条件非常接近。而之所以在两类大曲间呈现出如上所述的近缘种分布差异，可能与这一片区域环境中相关菌群本身的分布情况及其最适生长条件密切相关。
2.4.2 不同顶温类型大曲的主要真菌ASVs随机森林分析
通过随机森林预测及十倍交叉检验，可在所有真菌ASVs内部筛选出一个小型特征菌群集合，以最大程度地解释两类大曲真菌群落间的差异，结果如图5所示。各类群对群落差异的贡献程度由平均下降精度（Mean decrease accuracy）表示，由此筛选出排名最靠前的十个真菌ASV，它们作为群落中的潜在微生物标记物，对两类大曲菌群间的物种及功能差异具有显著影响。具体来说，这十个ASV分别属于三大类群，分别是Thermoascus crustaceus（5个）、Thermomyces spp.（4个）、Thermoascus aurantiacus（1个），其中前两个类群均在高温大曲中表现出明显富集，后者则在中温大曲中有更高占比。这一结果与上述的群落组成及组间差异分析相呼应，同时强调了这三类菌群在大曲真菌群落受温度影响向不同方向演替过程中表现出的重要性及代表性。
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图 5 基于随机森林的两类大曲真菌ASV差异分析Figure 5. Difference analysis of fungal communities between two types of Daqu at ASV level based on random forestThermomyces属是大曲中常见的优势耐热真菌，在贵州[28]、湖北[29]、安徽[17]等地高温大曲样品中均有报道，代表种为疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus），它能产生具有高热稳定性和活力的半纤维素酶[30]和淀粉水解酶（主要包括α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶）等[31]。但在本研究中，基于UNITE数据库的注释并未将Thermomyces类群定位到种水平。有鉴于此，我们将此类群中的高丰度ASV序列在NCBI数据库中进行进一步比对，发现诸如ASV_1、ASV_9、ASV_10等优势序列经由NCBI检索得到的最近缘物种均为Thermomyces lanuginosus，序列一致性分别为100%、99.63%、97.41%。因此，基本可以确定本研究相关结果中的unidentified Thermomyces实际主要对应着Thermomyces lanuginosus，而引起这一差异现象的主要原因可能是两个数据库本身的算法、存储存在一定差异。
2.5 大曲真菌群落主要菌属与理化指标的相关性分析
图6展示了两类大曲中相对丰度前10的真菌菌属与大曲理化指标之间的关系。在两类大曲中，水分均与酸度呈强负相关，均与还原糖呈正相关，这表明环境因子内部之间也可能通过菌群表现出稳定的相互作用。淀粉与糖化力、还原糖均呈负相关，这也呼应了淀粉分解生成还原糖的过程，即更高的糖化力代表着糖化酶促使淀粉更加高效地完成转化，使得大曲中淀粉含量下降的同时也积累了更多的还原糖。
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图 6 中温大曲及高温大曲优势菌属与理化指标的冗余分析注：A：中温大曲优势菌属与理化指标的冗余分析；B：高温大曲优势菌属与理化指标的冗余分析。Total acidity：总酸；Starch：粗淀粉；Moisture：水分；Reducing sugar：还原糖；Glucoamylase activity：糖化力。Figure 6. Redundancy analysis of major fungal genera and physicochemical indices in MT-Daqu and HT-Daqu在两类大曲中，Aspergillus、Rasamsonia、生丝毕赤酵母属（Hyphopichia）均与糖化力呈正相关。Aspergillus是大曲中的常见真菌，普遍具有较强的产淀粉酶和蛋白酶的能力，已有多株高产糖化酶的Aspergillus菌株从自然发酵体系中被分离筛选到，并反过来被初步应用于诸如麸醋[32]、白酒[33]等发酵体系的强化中。Rasamsonia也是一类具有丰富糖苷水解酶编码潜力的嗜热丝状真菌，具有较为完整的纤维素及半纤维素降解酶系，是开发耐热糖苷水解酶最具潜力的微生物之一[34]。与Hyphopichia相关的报道较少，但多出现在大曲研究中，唐慧芳等[35]发现其与老厂大曲淀粉水解能力呈强正相关，黄静[36]则发现其与夏季醋曲的糖化力呈强相关。本研究另发现Pichia在两类大曲中都与酸度呈强正相关，Thermoascus均与水分呈现强正相关，提示低酸度和低水分可能会明显扰动这两类菌群的分布。总的来说，确定与大曲理化指标显著相关的微生物，并通过筛选、纯化等技术应用于强化制曲过程中，对提高大曲质量具有较重要意义，这也是长期以来的研究方向。
3. 结论
本研究采用荧光定量PCR及高通量测序技术，对发酵过程中顶温温度不同的两类大曲真菌菌群进行了系统探究及差异分析，发现高温大曲整体真菌数量少于中温大曲，但高温大曲真菌群落在丰富度、多样性、均匀度上整体高于中温大曲。Thermoascus、Pichia、Aspergillus、Rhizopus在中温大曲中占比更高，其中以Thermoascus aurantiacus为绝对优势菌；Thermomyces、Rasamsonia、Monascus、Byssochlamys在高温大曲真菌群落中占比更高，其中以Thermomyces lanuginosus为绝对优势菌。根据随机森林模型预测，最能解释两类大曲菌群差异的前十个关键ASV分别归属于Thermoascus crustaceus、Thermomyces spp.和Thermoascus aurantiacus三大类群。另通过冗余分析解析大曲真菌群落结构与主要理化指标的相关性，为制曲工艺优化和潜力功能菌株筛选提供了一定参考数据。
尽管不同厂家在同类型大曲的工艺参数和原粮批次上可能存在一定差异，但在季节、环境等因素接近的情况下，同类型大曲样本真菌群落之间仍表现出较高的群落结构相似性，进一步证明了发酵的过程温度对真菌群落带来的深刻影响。本研究通过双来源样品的采集，在一定程度上减少了来源单一对结论可靠度的负面影响，对深入了解不同顶温类型大曲真菌菌群之间的共性及差异性有重要参考价值。
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图 1 不同分组大曲样品理化指标
注：图A、B、C标注的不同字母代表同一指标不同组别数值间存在显著性差异（P<0.05）；图D、E、F标注的*代表同一指标不同组别数值间存在显著性差异（P<0.05），**代表数值间存在极显著性差异（P<0.01）。
Figure 1. Physicochemical indices of Daqus of different groups
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图 2 中温大曲及高温大曲真菌群落常见α-多样性指数比较
注：**代表数值间存在极显著差异（P<0.01）；***代表数值间存在高度显著差异（P<0.001）。
Figure 2. Comparison of common α-diversity indices of fungal community in MT-Daqu and HT-Daqu
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图 3 中温大曲及高温大曲真菌群落组成及UPGMA聚类分析
Figure 3. Composition and UPGMA cluster analysis of fungal community in MT-Daqu and HT-Daqu
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图 4 中温大曲及高温大曲真菌群落主要类群的组间差异分析
注：A：属水平；B：种水平。
Figure 4. Inter-group differences of major taxa in fungal communities between MT-Daqu and HT-Daqu
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图 5 基于随机森林的两类大曲真菌ASV差异分析
Figure 5. Difference analysis of fungal communities between two types of Daqu at ASV level based on random forest
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图 6 中温大曲及高温大曲优势菌属与理化指标的冗余分析
注：A：中温大曲优势菌属与理化指标的冗余分析；B：高温大曲优势菌属与理化指标的冗余分析。Total acidity：总酸；Starch：粗淀粉；Moisture：水分；Reducing sugar：还原糖；Glucoamylase activity：糖化力。
Figure 6. Redundancy analysis of major fungal genera and physicochemical indices in MT-Daqu and HT-Daqu
表 1 Mixture A体系组成
Table 1 Composition of Mixture A
试剂 体积（µL） AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（2×） 10 10 μmol/L的PCR正向引物ITS1f 0.4 10 μmol/L的PCR反向引物5.8s 0.4 
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表 2 不同分组大曲样品真菌定量结果
Table 2 Quantification of fungi in Daqus of different groups
分组 基因拷贝数（/g干重） MT-A （3.838±0.969）×109 a MT-B （2.277±0.992）×109 a HT-A （1.862±0.445）×109 ab HT-B （3.420±1.545）×108 b 注：同列不同字母代表数值间存在差异性显著（P<0.05）。
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