Metabolomics Analysis of Metabolite Differences during the Storage Process of Laba Garlic Based on Machine Learning
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摘要: 本研究采用气相色谱-质谱法对不同储藏时间的腊八蒜进行非靶向代谢组学研究，利用多元统计分析，筛选出不同储藏时间腊八蒜的显著性代谢物，进一步利用深度学习支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）算法确定其标志性代谢物，并对其标志性代谢物的途径进行富集分析。结果表明，基于偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）为标准进行筛选，共筛选出57 种差异代谢物（VIP≥1，P<0.05，FDR<0.05），包括酸类（6种）、醇类（12种）、胺类（6种）、糖苷类（1种）、酯类（3种）、醚类（4种）、芳香类（13种）、烯烃类（2种）、其他（10种）。进一步地基于SVM-RFE过程筛选出6个标志性代谢物，其中5-己炔-1-醇是区别大蒜和腊八蒜的关键因素，而有机活性小分子肌醇、9-十八碳烯酰胺、硬脂酸、棕榈酸、苯甲酸是区分腊八蒜储藏的第35和85 d的关键因素。KEGG 富集分析表明，在腊八蒜储藏过程中较为重要的代谢通路为不饱和脂肪酸生物合成途径，脂肪酸生物合成，角质、亚伯碱和蜡的生物合成，抗坏血酸和醛糖酸代谢，脂肪酸链伸长系统，磷脂酰肌醇信号系统，半乳糖代谢，磷酸肌醇代谢，脂肪酸降解。本研究解析出的腊八蒜储藏过程中6种标志性代谢物可以为腊八蒜的储藏和评价提供理论基础。Abstract: In this study, non-targeted metabolomic research was conducted using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) on Laba garlic at different storage times to explore the signature metabolite changes during storage. Multivariate statistical analysis was used to screen out the significant metabolites of Laba garlic at different storage times. Further, the deep learning support vector machine recursive feature elimination (SVM-RFE) algorithm was used to determine its landmark metabolites, and enrichment analysis of the pathways of its landmark metabolites was carried out. A total of 57 different metabolites were screened out (VIP≥1, P<0.05, FDR<0.05) based on partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) as a criterion for screening, including acids (6), alcohols (12), amines (6), glycosides (1), esters (3), ethers (4), aromatics (13), olefins (2), and others (10). Further, 6 landmark metabolites were screened based on the SVM-RFE process, among which 5-hexyn-1-ol was the key factor to distinguish garlic and Laba garlic, while the organic active small molecule including inositol, 9-octadecenamide, stearic acid, palmitic acid and benzoic acid were the key factors to distinguish the 35th and 85th days of Laba garlic storage. KEGG enrichment analysis indicated that the more important metabolic pathways during storage were biosynthesis of unsaturated fatty acid, fatty acid biosynthesis, cutin, suberine and wax biosynthesis, ascorbate aldarate metabbolism, fatty acid elongation, phosphatidylinositol signaling system, galactose metabolism, inositol phosphate metabolism and fatty acid degradation. The six landmark metabolites in the storage process of Laba garlic analyzed in this study would provide a theoretical basis for the storage and evaluation of Laba garlic.
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Keywords:
- metabolomics /
- Laba garlic /
- machine learning /
- landmark metabolites /
- support vector machine (SVM)
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我国地域辽阔，大蒜品种资源丰富，据联合国粮食及农业组织（FAO）数据显示我国大蒜种植面积和产量均居世界第一，截止到2021年，中国大蒜种植面积为1013万亩，大蒜产量为2162.5万吨。相比于其它蔬菜，大蒜被推荐为人们日常消耗食物中多酚类物质的重要来源之一[1]。目前我国大蒜以原料和初级产品加工为主。将产量丰富的新鲜大蒜进行深加工，一方面可以解决大蒜在贮藏过程中因呼吸作用或腐败变质而造成的浪费，另一方面可以提高大蒜产品的附加值，优化我国大蒜产业结构，提高我国大蒜出口竞争能力。所以，研究大蒜加工过程，对于进一步开发我国大蒜深加工产品以及品质保证均具有重要意义。
腊八蒜是众多大蒜加工产品之一，是中国的传统美食，日久岁深。因其颜色碧绿、酸甜爽口颇受我国北方地区人民喜爱，但腊八蒜绿色素不稳定，随着储藏时间的延长，其颜色会逐渐变黄。多年来国内外学者十分注重对腊八蒜的护色研究，通过物理法[2]、化学法[3]等延长腊八蒜维持绿色状态的时间，目前，市场上的腊八蒜的保质期一般为1~3个月。
代谢组学是一种以高通量检测技术来检测生物样品中小分子代谢物的方法，可用于探索代谢物在不同时间的变化情况，因此被广泛应用于食品的代谢物组分变化研究中，如辣椒、黄酒等，但在腊八蒜方面的应用研究还较少，现有的应用主要集中在腊八蒜的品质评价[4]，关于腊八蒜与白蒜之间、不同储藏时间的腊八蒜之间差异代谢物等的研究还未见报道。
机器学习作为一种分析高通量数据的新型手段，是统计学、人工智能和计算机科学的交叉学科，随着方法的日益成熟，越来越多研究者将其开发应用于生命科学领域[5-6]。本文以腊八蒜为研究对象，采用机器学习结合代谢组学分析，研究腊八蒜与白蒜之间以及不同储藏时间点的腊八蒜样品之间的代谢物差异，并结合多元统计分析和深度学习SVM-RFE算法，获得不同样品的标志性代谢物，分析相关的代谢通路，以期为腊八蒜储藏过程中标志性代谢产物的筛选及其生产工艺品质控制提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
优质保鲜蒜米 购自龙腾蒜业，挑选样品大小均匀，表面无破损，直径在5.5 cm左右且收获期一致，将样品于实验室冰箱（4 ℃）保存；白米醋 杭州市食品酿造有限公司；甲醇 色谱纯，德国默克公司；正构烷烃（C7~C30）（纯度≥98%）、N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA）（纯度≥99%）、甲氧胺盐酸盐（纯度≥99%）、吡啶（色谱纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；核糖醇 纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司。
FA2004电子天平 上海舜宇横平科学仪器有限公司；Free Zone 2.5 L冷冻干燥机 美国Labconco有限公司；Allegra X-12R冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；JT-DCY-12Y水浴氮吹仪 杭州聚同电子有限公司；CHA-2恒温气浴箱 苏州威尔实验用品有限公司；Agilent 7890-5975C气相色谱串联质谱仪 安捷伦科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品准备
取5 kg保鲜蒜米，利用去离子水清洗三次，放入大10 L玻璃罐中，加入4 kg白米醋浸泡，于25 ℃下浸泡15 d，然后置于4 ℃冰箱储藏，分别于储藏的第35 d（绿色）、第85 d（黄色）取样，每个时间点取5个重复样本，以白蒜为空白对照，进行各项品质指标的测定。
1.2.2 色泽测定
将腊八蒜样品置于液氮中冷冻15 min，于−80 ℃保存24 h后真空冷冻干燥。将冻干的样品粉碎，过80目筛，置于干燥器内保存。采用色差仪对样品的色差进行分析，记录样品的L*、a*、b*值，每个样品重复三次并取平均值。
1.2.3 样本前处理
称取粉碎后的样品约50 mg至EP管中，加入1 mL去离子水（含25 μg核糖醇），漩涡混合5 s，600 W超声处理15 min，13000 r/min离心15 min，分离得到上清液和残渣。保留上清液，向残渣中加入1 mL的甲醇进行同样的提取处理。合并两次上清液，进行衍生化（胺化）反应。每个待测样本取等体积混合后制成QC样本，用以校正混合样品分析结果产生偏差以及由于仪器自身原因造成的失误。取800 μL的上清液样品，用氮吹仪吹干。加入100 μL甲氧胺盐试剂（每1 mL吡啶溶解15 mg甲氧胺盐酸盐），轻轻混匀后，放置37 ℃ 恒温箱胺化2 h；然后加入100 μL MSTFA（含有1% TMCS，V/V），37 ℃继续胺化30 min后过0.22 μm微孔滤膜，上机检测，每个时间点5组样品，每个样品做3次个重复。
1.2.4 GC-MS分析
色谱条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），升温程序为起始温度80 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升温至300 ℃并保持12 min；载气为氦气；进样模式为不分流；进样量为1 μL。质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度240 ℃；母离子m/z 285；激活电压1.2 kV；质量扫描范围m/z 50～650；采用标准烷烃混合物（C7~C30）进行GC-MS质量控制和保留指数计算[7]。采用NIST14数据库（对荷质比m/z进行比较）进行定性分析，最终得到代谢物鉴定结果。
1.3 数据处理
主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、偏最小二乘分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）、聚类热图分析、代谢通路分析和可视化使用的是Metaboanalyst 5.0（http://www.metaboanalyst.ca），SVM-RFE算法使用R统计软件（http://www.r-project.org）。
首先采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）等多元统计方法对腊八蒜样品进行差异分析，利用模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值、t检验（t-test）的P（P-value）值以及方差分析的FDR（False Discovery Rate）值来研究比较空白对照、第35和第85 d的组间代谢物差异，以P<0.05且FDR<0.05和VIP≥1作为截止标准，鉴定差异代谢物。第0、50、100 d腊八蒜之间标志性代谢物的筛选使用R统计软件包（http://www.r-project.org）中的Limma软件包进行。使用Limma的线性模型进行背景校正和归一化处理。使用caret包中的RFE函数进行标志性代谢物选择，并进行5倍交叉验证[8]。SVM分类器使用带有5倍交叉验证的R包e1071构建。P<0.05被认为表明差异有统计学意义[9]。代谢通路分析使用基于京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）代谢途径库的MetaboAnalyst 5.0对所有具有统计学意义的代谢物进行。
2. 结果与分析
2.1 储藏过程中腊八蒜色差变化
色泽是衡量腊八蒜品质的重要物理指标，腊八蒜储藏过程中的色差分析见表1，其中L*值表示样品的明度，a*值代表红（+）绿（−）色度，b*值显示黄（+）蓝（−）色度。由表1可知，在储藏过程中L*值依次减小；a*值则先减小后增大，而b*值依次增大，说明腊八蒜在储藏过程中颜色逐渐由黄绿色变为黄色，储藏第35 d的样品可以维持腊八蒜的色泽，之后，样品的色差变化小，储藏至第85 d的样品失去绿色。
表 1 腊八蒜储藏过程中L*、a*、b*值的变化Table 1. Change of L*, a* and b* values of Laba garlic during the storage process贮藏时间（d） L* a* b* 空白对照 94.63 0.34 14.69 35 79.85 −3.26 34.78 85 74.90 0.44 40.02 2.2 腊八蒜不同储藏时间点样品数据采集分析
将质控（quality control，QC）样本的总离子流图进行谱图重叠比较，如图1a所示，QC样本的基线稳定，各色谱图峰的相应强度和保留时间基本一致，说明仪器数据采集稳定性较好，在整个实验过程中仪器误差引起的变异较小。由图1b可知不同储藏时间点的腊八蒜总离子流图有明显的不同，说明三组间的代谢物组成有明显的差异。
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图 1 腊八蒜不同储藏时间点及质控样品的总离子流图注：a：腊八蒜质控样品谱图；b：不同储藏时间的腊八蒜样品谱图。Figure 1. Total ion current diagram of Laba garlic at different storage time points and quality control samples2.3 PCA和PLS-DA分析
在无监督PCA得分图中，每个实心圆代表一个样本，对代谢物进行主成分分析可以总体反映样本组间和组内差异，观察样本间的总体分布趋势，判断可能存在的变异点[10]，如图2所示，得分图的所有样本都在95%置信椭圆内，这说明在被分析的样本中不存在异常值。而且从图形中可以看出，储藏第35 和第85 d的样品在PC1上有聚类，和空白对照组有明显的分离，初步认为大蒜原料和腊八蒜之间的代谢物有显著差异，同时储藏第35和第85 d的样品在PC2上有显著分离，则说明储藏过程中部分代谢物变化对腊八蒜的品质有很大的影响[11]。而R2X=0.29，说明两个主成分的贡献率为29%，拟合性不是很好，Q2=0.193，与R2X相差较小，说明拟合方程的稳定性较好。
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图 2 主成分分析（PCA） （n=15）Figure 2. Principal component analysis (PCA) drawing Laba garlic samples (n=15)PLS-DA 是在 PCA 的基础上，多因变量对多自变量的回归建模方法，该有监督判别统计方法可弥补PCA无法剔除差异变量的不足，在产品质量预报、毒物分析、食品分析、环境化学等方面有着广泛的应用[12]。在PLS-DA模型中，R2Y和Q2的值常用于判断其稳定性和观察原始数据的可靠性，一般成功的模型两者的值都接近1[13]。如图3所示，R2Y=0.963，Q2=0.936，表明模型能很好地解释样本间的差异。为防止模型过拟合，采用200次响应的置换检验（Response Permutation Testing，RPT检验）对模型进行验证，其中R2、Q2为回归直线与y轴的截距值，R2表示模型能够解释的方差总和，Q2表示模型的预测能力；使用RPT检验时，一般要求Q2小于零。由图4可知，R2=0.569，Q2=−0.257，回归线呈向上的趋势，Q2小于零，没有出现过拟合的现象，模型可靠，可用于后续的分析。
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图 3 偏最小二乘-判别分析（PLS-DA） （n=15）Figure 3. Partial least squares analysis (PLS-DA) was used to draw Laba garlic samples (n=15)2.4 差异代谢物的筛选
VIP值通常用来反映PLS-DA模型变量的重要性，VIP值越大表示该变量越重要[12]。根据PLS-DA模型进行差异代谢物的筛选，共筛选出57 种差异代谢物（VIP≥1，P<0.05，FDR<0.05），如表2所示，差异代谢物的热图如图5所示。
表 2 不同储藏时间腊八蒜中差异代谢物筛选结果Table 2. Screening results of different metabolites in Laba garlic with different storage time编号 化合物名称 VIP值 P值 FDR值 v3 硬脂酸 1.83 2.20E-07 1.59E-06 v4 棕榈酸 1.73 8.84E-06 4.75E-05 v5 苯甲酸 1.71 1.19E-33 5.76E-32 v51 草酸 1.06 2.05E-05 8.48E-05 v29 苯甲酸衍生物 1.18 1.90E-05 8.09E-05 v12 二亚油酸 1.48 7.16E-15 2.08E-13 酸类6种 v2 肌醇 1.91 2.69E-12 4.88E-11 v10 丁四醇 1.49 2.82E-11 3.72E-10 v15 甘油 1.40 2.46E-11 3.57E-10 v24 5-己炔-1-醇 1.23 4.69E-08 4.25E-07 v28 硫二甘醇 1.19 1.69E-05 7.45E-05 v31 双甘油 1.17 1.28E-06 8.07E-06 v52 三异丙基硅烷醇 1.05 0.000582 0.001383 v53 别嘌呤醇 1.03 7.80E-05 0.00029 v16 苏糖醇 1.40 1.18E-11 1.90E-10 v27 赤藓糖醇 1.20 8.78E-05 0.000301 v43 阿糖醇 1.09 0.00011 0.000355 v56 木糖醇 1.01 1.44E-05 6.52E-05 醇类12种 v1 9-十八碳烯酰胺 1.97 2.60E-46 3.77E-44 v6 棕榈酰胺 1.67 2.25E-12 4.67E-11 v9 硬脂酸酰胺 1.52 2.50E-08 2.58E-07 v18 4-乙基苯甲酰胺 1.33 7.31E-08 6.24E-07 v19 丙酰乙基苯丙胺 1.32 1.37E-06 8.26E-06 v41 三炔丙基胺 1.10 0.000143 0.000426 胺类6种 v55 阿拉伯糖苷 1.03 0.000775 0.001703 糖苷类1种 v33 棕榈酸甲酯 1.14 8.94E-05 0.000301 v36 棕榈酸甘油酯 1.13 0.001184 0.002345 v57 氯代磷酸二乙酯 1.00 0.007507 0.010269 酯类3种 v20 4-茴香醚 1.32 2.68E-05 0.000108 v22 儿茶酚次甲醚 1.24 0.000541 0.001329 v30 2-羟乙基丁基硫醚 1.17 4.80E-06 2.68E-05 v54 邻苯二甲醚 1.03 0.004743 0.006678 醚类4种 v8 噻吩 1.52 3.05E-08 2.94E-07 v11 苄腈 1.49 3.34E-19 1.21E-17 v14 2-丁基噻唑呤 1.43 1.59E-10 1.93E-09 v21 溴胺苯 1.25 2.39E-06 1.39E-05 v23 3-苯基-4-异恶唑-5-酮 1.24 1.04E-07 8.40E-07 v25 1-氢咪唑并[1,2-b]吡唑，2,3-二氢 1.21 8.77E-05 0.000301 v32 2-肼吡啶 1.15 1.01E-06 6.62E-06 v42 2,2-乙烯双（1,3-二噻烷） 1.10 1.03E-05 5.14E-05 v44 四氢噻喃-4-酮 1.09 0.000504 0.001281 v46 6-氨基-2-甲基喹啉 1.08 0.000484 0.001275 v47 3-氨基二苯并呋喃 1.07 1.16E-05 5.58E-05 v48 2-氨基二苯并呋喃 1.07 1.30E-05 6.06E-05 v49 2-（乙胺基）-1,3,4-噻二唑 1.07 0.000144 0.000426 芳香类14种 v7 3-乙烯基-1,2-二硫环己-4-烯 1.66 9.19E-35 6.66E-33 v37 3-乙烯基-1,2-二硫环己-5-烯 1.12 1.24E-07 9.43E-07 烯烃类2种 v13 5-甲基-2-糠醛 1.47 2.05E-08 2.28E-07 v17 丁烷 1.38 1.79E-12 4.34E-11 v26 戊烷 1.20 8.87E-05 0.000301 v34 醋酸甲脒 1.13 0.000521 0.001303 v35 2-乙烯基-1,3-二噻烷 1.13 9.68E-07 6.62E-06 v38 交叉三环化合物 1.11 0.000474 0.001272 v39 4-羟基苯乙腈 1.11 9.59E-06 4.97E-05 v40 丙腈 1.10 0.000161 0.000466 v45 乙二醇毒素 1.08 0.002991 0.005046 v50 三十一碳烷 1.06 0.006328 0.008738 其他10种 注：化合物名称对应编号顺序全文同。 ![]()
图 5 不同样品组的差异代谢物热图Figure 5. Heat map of different metabolites in different sample groups通过表2可知，腊八蒜在储藏过程中的差异代谢物主要包括酸类（6种）、醇类（12种）、胺类（6种）、糖苷类（1种）、酯类（3种）、醚类（4种）、芳香类物（13种）、烯烃类（2种）、其他（10种），共57种。利用热图聚类分析可将储藏第35和第85 d的样品组聚为一类，验证了2.3中PCA的结论。
酸类代谢物在储藏过程中总相对含量不断升高。腊八蒜在储藏过程中是浸泡在酸性环境中的，而且腊八蒜口感偏酸，因此酸类化合物在其中发挥着重要作用。从图5中可以看出，随着储藏时间的延长，VIP值较大的饱和脂肪酸（硬脂酸（v3）、棕榈酸（v4））、苯甲酸（v5）的相对含量不断增加，而不饱和脂肪酸（亚油酸（v12））是仅在空白组中出现，草酸（v51）的相对含量则是先增加后减小。苯甲酸是植物的次级代谢产物，在植物应对生物或非生物胁迫时也起着重要的作用[14]；将大蒜置于酸性环境中后，样品中的苯甲酸的相对含量会逐渐增高。
醇类作为广泛分布在植物中的生物标记物之一，在腊八蒜的储藏过程中也发挥着重要作用[15]。由图6可知，醇类化合物的相对含量在储藏第35 d时达到最高，第85 d次之，空白组最少。醇类中VIP值最高的是肌醇（v2，VIP=1.9），其余的醇类物质VIP值都小于1.5。肌醇是化学上非常稳定的极性小分子，属于B族维生素，是微生物的生长因子，它和它的衍生物参与磷脂酸酰肌醇信号通路，作为信号分子和关键代谢产物行使双重功能，在植物的生长和胁迫应答过程中起协调作用，并且具有一定的抗氧化作用[16]，其合成需要消耗糖酵解的中心代谢物葡萄糖-6-磷酸。刘建[4]研究发现腊八蒜加工后期（腊八蒜由绿变黄），糖醇含量明显下降而蒜醋液中糖醇含量升高，本研究肌醇在储藏的第85 d样品中的相对含量显著低于储藏的第35 d的样品，可能也与肌醇的逐渐溶出有关。除此之外，5-己炔-1-醇（v24）等不饱和醇只出现在空白组，炔醇类化合物药理作用广泛，具有抗肿瘤、抗炎等作用[17]。甘油（v10）、苏糖醇（v16）、赤藓糖醇（v27）在储藏的第85 d的相对含量最高，阿糖醇（v43）、木糖醇（v56）在储藏的第35 d最高。
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图 6 不同储藏时间样品中各类化合物累积相对含量变化Figure 6. Cumulative relative contents of various compounds in Laba garlic at different storage times胺类化合物中多为酰胺化合物，其相对含量整体呈现先上升后下降的趋势。VIP值高于1.5的胺类化合物有：9-十八碳烯酰胺（v1）、棕榈酰胺（v6）和硬脂酸酰胺（v9），但上述3种物质均只出现在储藏第35 d的样品中。9-十八碳烯酰胺是一种玛咖酰胺类物质，玛咖酰胺具有抗疲劳、抗抑郁、促进生育、保护神经、抗骨质酥松等作用[18]。
糖苷类和脂类化合物的相对含量较低，醚类、芳香类、烯烃类以及其他类化合物的相对含量变化趋势相同。研究发现，VIP大于1.5的代谢物中的3-乙烯基-1,2-二硫环己-4-烯（v7）具有抗氧化活性[1]。
2.5 标志性代谢物的筛选
SVM-RFE过程（后向特征选择过程）是通过不断的迭代，每次删除w2值最小的特征，最终得到一个属性的排序，然后通过交叉验证的方法确定最好的特征子集。与PLS-DA（Filter方法）相比，SVM-RFE（Wrapper方法）分类正确率的结果一般会更好，而且特征选择数量上会更少，但在时间方面SVM-RFE也更耗时[19-21]。在PLS-DA筛选出的差异代谢物的基础上进行SVM-RFE标志性代谢物的筛选既提高了分类预测的正确率，又缩短了时间，提高了效率[22]。
由图7可知，基于SVM-RFE算法，将PLS-DA模型下的57 个差异代谢物在SVM分类器中进一步拟合，得出了均方根误差最小的6个代谢物，分别为：9-十八碳烯酰胺（v1）、肌醇（v2）、硬脂酸（v3）、棕榈酸（v4）、苯甲酸（v5）、5-己炔-1-醇（v24），进入SVM分类器，其误差为0，预测正确率为100%。观察图5可知，5-己炔-1-醇在空白组中的表达极其显著，9-十八碳烯酰胺、肌醇在储藏的第35 d的样品中相对含量最高，硬脂酸、棕榈酸、苯甲酸在储藏的第85 d的样品中相对含量最高，6个代谢物分别标志了三个不同时间段。
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图 7 通过SVM-RFE算法得出的特征代谢物选择图注：a代表模型错误率；b代表模型准确率。Figure 7. A plot of characteristic metabolites selection by recursive feature elimination2.6 标志性代谢物的通路分析
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）即京都基因及基因组百科全书，是汇集了基因组、生物化学产物、分子互作网络等信息的在线数据库[23]。通过KEGG对6 种标志性代谢物进行途径富集分析[24]，揭示了空白组、储藏的第35和85 d的腊八蒜样品中标志性代谢物的代谢途径。从图8中可以看出，一共有9条代谢通路：不饱和脂肪酸生物合成途径（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）、脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）、角质、亚伯碱和蜡的生物合成（Cutin, suberine and wax biosynthesis）、抗坏血酸和醛糖酸代谢（Ascorbate and aldarate metabolism）、脂肪酸链伸长系统（Fatty acid elongation）、磷脂酰肌醇信号系统（Phosphatidylinositol signaling system）、半乳糖代谢（Galactose metabolism）、磷酸肌醇代谢（Inositol phosphate metabolism）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）。其中P值小于0.05的代谢通路有不饱和脂肪酸生物合成途径、脂肪酸生物合成、角质、亚伯碱和蜡的生物合成途径。9条代谢通路中与硬脂酸代谢相关的通路有5条，其中有2条同时与棕榈酸相关，另外4条通路与肌醇相关。
Tao等[25]研究表明，腊八蒜的绿变是由醋对大蒜细胞的损伤所触发的，即在醋中浸泡会损伤大蒜的细胞膜，使得大蒜细胞内的蒜氨酸和蒜氨酸酶得以接触，在短时间内反应产生大蒜素，大蒜素和一些色素前体化合物继续反应，并引发一系列的酶促反应和非酶促反应，最终生成色素类物质，使腊八蒜表现为绿色。而程碧君[26]发现蒜氨酸通过P53/AMPK/mTOR信号通路激活自噬从而改善1,3-DCP诱导的脂质积累。同时蒋绪顺[27]等发现棕榈酸也可以诱导足细胞内的自噬增加和脂质积累。在9条代谢通路中的不饱和脂肪酸生物合成途径和脂肪酸生物合成、脂肪酸链伸长系统以及脂肪酸降解均与脂质积累相关，推测硬脂酸和棕榈酸等脂肪酸对绿变过程中有一定的影响。
3. 结论
综上所述，基于GC-MS的非靶向代谢组学研究显示，在相同储藏条件下，不同储藏时期的腊八蒜具有明显的代谢物特征。经筛选得到的腊八蒜差异代谢物57种，为腊八蒜的生产和研发提供了重要的科学信息。此外，从57种差异代谢物种筛选出来的6 种标志性代谢物表明挥发性物质（5-己炔-1-醇）是区别大蒜和腊八蒜的关键因素，而有机活性小分子肌醇、9-十八碳烯酰胺、硬脂酸、棕榈酸、苯甲酸是区分储藏的第35和85 d的关键因素，储藏至第35 d的腊八蒜呈黄绿色，第85 d时完全失去绿色。因此在储藏腊八蒜的过程中可以通过以上代谢成分的变化来进行储藏质量的评价，并用于指导腊八蒜的加工和生产。
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图 1 腊八蒜不同储藏时间点及质控样品的总离子流图
注：a：腊八蒜质控样品谱图；b：不同储藏时间的腊八蒜样品谱图。
Figure 1. Total ion current diagram of Laba garlic at different storage time points and quality control samples
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图 2 主成分分析（PCA） （n=15）
Figure 2. Principal component analysis (PCA) drawing Laba garlic samples (n=15)
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图 3 偏最小二乘-判别分析（PLS-DA） （n=15）
Figure 3. Partial least squares analysis (PLS-DA) was used to draw Laba garlic samples (n=15)
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图 5 不同样品组的差异代谢物热图
Figure 5. Heat map of different metabolites in different sample groups
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图 6 不同储藏时间样品中各类化合物累积相对含量变化
Figure 6. Cumulative relative contents of various compounds in Laba garlic at different storage times
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图 7 通过SVM-RFE算法得出的特征代谢物选择图
注：a代表模型错误率；b代表模型准确率。
Figure 7. A plot of characteristic metabolites selection by recursive feature elimination
表 1 腊八蒜储藏过程中L*、a*、b*值的变化
Table 1 Change of L*, a* and b* values of Laba garlic during the storage process
贮藏时间（d） L* a* b* 空白对照 94.63 0.34 14.69 35 79.85 −3.26 34.78 85 74.90 0.44 40.02 
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表 2 不同储藏时间腊八蒜中差异代谢物筛选结果
Table 2 Screening results of different metabolites in Laba garlic with different storage time
编号 化合物名称 VIP值 P值 FDR值 v3 硬脂酸 1.83 2.20E-07 1.59E-06 v4 棕榈酸 1.73 8.84E-06 4.75E-05 v5 苯甲酸 1.71 1.19E-33 5.76E-32 v51 草酸 1.06 2.05E-05 8.48E-05 v29 苯甲酸衍生物 1.18 1.90E-05 8.09E-05 v12 二亚油酸 1.48 7.16E-15 2.08E-13 酸类6种 v2 肌醇 1.91 2.69E-12 4.88E-11 v10 丁四醇 1.49 2.82E-11 3.72E-10 v15 甘油 1.40 2.46E-11 3.57E-10 v24 5-己炔-1-醇 1.23 4.69E-08 4.25E-07 v28 硫二甘醇 1.19 1.69E-05 7.45E-05 v31 双甘油 1.17 1.28E-06 8.07E-06 v52 三异丙基硅烷醇 1.05 0.000582 0.001383 v53 别嘌呤醇 1.03 7.80E-05 0.00029 v16 苏糖醇 1.40 1.18E-11 1.90E-10 v27 赤藓糖醇 1.20 8.78E-05 0.000301 v43 阿糖醇 1.09 0.00011 0.000355 v56 木糖醇 1.01 1.44E-05 6.52E-05 醇类12种 v1 9-十八碳烯酰胺 1.97 2.60E-46 3.77E-44 v6 棕榈酰胺 1.67 2.25E-12 4.67E-11 v9 硬脂酸酰胺 1.52 2.50E-08 2.58E-07 v18 4-乙基苯甲酰胺 1.33 7.31E-08 6.24E-07 v19 丙酰乙基苯丙胺 1.32 1.37E-06 8.26E-06 v41 三炔丙基胺 1.10 0.000143 0.000426 胺类6种 v55 阿拉伯糖苷 1.03 0.000775 0.001703 糖苷类1种 v33 棕榈酸甲酯 1.14 8.94E-05 0.000301 v36 棕榈酸甘油酯 1.13 0.001184 0.002345 v57 氯代磷酸二乙酯 1.00 0.007507 0.010269 酯类3种 v20 4-茴香醚 1.32 2.68E-05 0.000108 v22 儿茶酚次甲醚 1.24 0.000541 0.001329 v30 2-羟乙基丁基硫醚 1.17 4.80E-06 2.68E-05 v54 邻苯二甲醚 1.03 0.004743 0.006678 醚类4种 v8 噻吩 1.52 3.05E-08 2.94E-07 v11 苄腈 1.49 3.34E-19 1.21E-17 v14 2-丁基噻唑呤 1.43 1.59E-10 1.93E-09 v21 溴胺苯 1.25 2.39E-06 1.39E-05 v23 3-苯基-4-异恶唑-5-酮 1.24 1.04E-07 8.40E-07 v25 1-氢咪唑并[1,2-b]吡唑，2,3-二氢 1.21 8.77E-05 0.000301 v32 2-肼吡啶 1.15 1.01E-06 6.62E-06 v42 2,2-乙烯双（1,3-二噻烷） 1.10 1.03E-05 5.14E-05 v44 四氢噻喃-4-酮 1.09 0.000504 0.001281 v46 6-氨基-2-甲基喹啉 1.08 0.000484 0.001275 v47 3-氨基二苯并呋喃 1.07 1.16E-05 5.58E-05 v48 2-氨基二苯并呋喃 1.07 1.30E-05 6.06E-05 v49 2-（乙胺基）-1,3,4-噻二唑 1.07 0.000144 0.000426 芳香类14种 v7 3-乙烯基-1,2-二硫环己-4-烯 1.66 9.19E-35 6.66E-33 v37 3-乙烯基-1,2-二硫环己-5-烯 1.12 1.24E-07 9.43E-07 烯烃类2种 v13 5-甲基-2-糠醛 1.47 2.05E-08 2.28E-07 v17 丁烷 1.38 1.79E-12 4.34E-11 v26 戊烷 1.20 8.87E-05 0.000301 v34 醋酸甲脒 1.13 0.000521 0.001303 v35 2-乙烯基-1,3-二噻烷 1.13 9.68E-07 6.62E-06 v38 交叉三环化合物 1.11 0.000474 0.001272 v39 4-羟基苯乙腈 1.11 9.59E-06 4.97E-05 v40 丙腈 1.10 0.000161 0.000466 v45 乙二醇毒素 1.08 0.002991 0.005046 v50 三十一碳烷 1.06 0.006328 0.008738 其他10种 注：化合物名称对应编号顺序全文同。
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