Preparation and Properties of Whey Protein Concentrate and Egg White Protein Composite Film
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摘要: 本文以乳清蛋白(Whey protein concentrate,WPC)和卵清蛋白(Egg white protein,EWP)为成膜基质,添加5 U/g蛋白转谷氨酰胺酶(Transglutaminase,TG)制备WPC/EWP复合膜,分别研究WPC和EWP质量比、膜液pH、甘油添加量对WPC/EWP复合膜结构及性能的影响。结果表明,当WPC/EWP质量比为1:3,成膜液pH为8,甘油添加量为35%时,电镜结果表明形成的复合膜结构致密无孔隙,红外结果显示WPC和EWP有较好的相容性。WPC/EWP复合膜的水蒸气透过率为2.08×10−10 g·s−1m−1Pa−1,透光率为73.90%,抗拉强度为1.60 MPa,断裂伸长率为151.96%。WPC、EWP和甘油在膜液pH为8时具有良好的融合性,能显著(P<0.05)提高WPC/EWP复合膜的机械性能。Abstract: In this study, whey protein concentrate (WPC) and egg white protein (EWP) were used as film forming substrates and 5 U/g protein transglutaminase (TG) was added to prepare WPC/EWP composite film. The effects of the mass ratio of WPC and EWP, pH of film-forming solutions and glycerin content on the properties of WPC/EWP composite film were investigated. Result showed that, when the mass ratio of WPC/EWP was 1:3, the pH of the film-forming solutions was 8, and the glycerol content was 35%. The results of electron microscope showed that the structure of composite film was compact without porosity. The infrared results showed that WPC and EWP had good compatibility. The water vapor permeability of WPC/EWP composite film was 2.08×10−10 g·s−1m−1Pa−1, the transmittance was 73.90%, the tensile strength was 1.60 MPa, and the elongation at break was 151.96%. WPC, EWP and glycerol had good fusion at pH8, which could significantly (P<0.05) improve the mechanical properties of WPC/EWP composite film.
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合成包装材料造成的环境污染促使了新型环保材料的发展,生物聚合物薄膜和涂层因其可生物降解性而受到越来越多的重视[1]。可食性薄膜作为食品包装材料,可以延缓食品劣变,从而提高食品质量,延长保质期[2]。
乳清浓缩蛋白(WPC)主要通过氢键、二硫键与其他分子的相互作用来维持其特征结构[3],具有良好的成膜性能、优异的阻气性能和两亲性等功能特性,已成为一种很有前途的生物基聚合物。卵清蛋白(EWP)营养丰富具有很好的成膜性,形成的膜具有较好的透光性[4]。但因蛋白基膜的机械性能和阻隔性能较差,常用化学[5]、物理[6]、酶法[7]改性。赵晓彤等[8]以大豆分离蛋白为成膜材料,添加聚乙烯醇和纳米纤维素,辅以超声处理制备的复合膜阻隔性能和机械性能提高。Zhang等[9]通过美拉德反应将木糖糖基化,制备了面筋/玉米醇溶蛋白纳米纤维膜,结果表明糖化后的复合膜由于分子间的缠结和高分子链之间的相互作用增强,水蒸气透过率降低,网络结构更加致密。转谷氨酰胺酶(TG)能诱导谷氨酰胺的酰胺基和赖氨酸的氨基发生共价交联。Fernandez-Bats等[10]以豌豆蛋白为原料,经TG酶交联,添加二氧化硅纳米颗粒制备复合膜,研究结果发现,添加TG酶后提高了薄膜对气体和水蒸气的阻隔作用。Rossi等[11]添加TG酶制备乳清蛋白/果胶复合膜,发现添加TG酶后可有效防止鲜切苹果和马铃薯在贮藏10 d内腐烂。
课题组前期研究中以WPC和EWP为成膜基质、添加TG酶(5 U/g蛋白)处理,成功制备出性能较好的WPC/EWP复合膜。因此,本研究进一步深入研究WPC和EWP质量比、膜液pH、甘油添加量对WPC/EWP复合膜的机械性能、阻隔性能和微观结构的影响,以期为WPC/EWP复合膜的实际开发应用提供理论与技术指导。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
乳清浓缩蛋白 食品级,德国米莱乳品公司;蛋清蛋白 食品级,美国Sigma-Aldrich公司;转谷氨酰胺酶 食品级,江苏一鸣生物制品有限公司;甘油 分析纯,天津市大茂化学试剂厂。
V-100D可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;TA-XT plus质构仪 英国Stable Micro System公司;JSM-7800F场发射扫描电子显微镜 日本电子株式会社;Spectrum10傅里叶变换红外光谱仪 美国Perkin Elmer公司;SL200KB接触角分析仪 美国Kino公司;Binder KBF115恒温恒湿箱 德国Binder有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 膜制备方法
用WPC和EWP为基准,按质量比(g/g)混合后使用超纯水进行制备,使WPC和EWP在水中的质量分数为8%,并磁力搅拌至完全溶解,在4 ℃冰箱放置过夜。溶液放置室温后将5 U/g蛋白的TG酶添加到混合液中,在50 ℃下孵育2 h。反应后,80 ℃水浴10 min并冷却至室温[12]。以蛋白质质量为基准,在成膜溶液中添加甘油作增塑剂,在25 ℃下磁力搅拌1 h后,量取9 mL溶液立即浇铸在塑料平皿(90 mm×90 mm)上,于30 ℃、相对湿度为50%的恒温恒湿箱中烘干成膜12 h。揭膜后在25 ℃、相对湿度50%条件下回软24 h,备用。
1.2.2 不同底物质量比复合膜的制备
改变WPC和EWP质量比(1:0、3:1、1:1、1:3、0:1),将成膜液pH调到7,以蛋白质量计添加45%的甘油,其余条件不变,按照1.2.1的方法制备复合膜。
1.2.3 不同膜液pH复合膜的制备
以WPC和EWP质量比为1:3(g/g)制备膜液,将膜液调为不同的pH(6、7、8、9、10)以蛋白质量计添加45%的甘油,其余条件不变,按照1.2.1的方法制备复合膜。
1.2.4 不同甘油添加量复合膜的制备
以WPC和EWP质量比为1:3(g/g)制备膜液,将膜液调为8,添加不同的甘油添加量(25%、35%、45%、55%、65%)(以蛋白质量计),其余条件不变,按照1.2.1的方法制备复合膜。
1.3 性能测定方法
1.3.1 膜厚度
使用灵敏度为0.001 mm的数显千分尺随机确定薄膜厚度[13]。在薄膜表面随机取5个测量薄膜厚度,最终厚度被视为5次测量的平均值。
1.3.2 扫描电子显微镜
用扫描电子显微镜(SEM)在20 kV加速电压下观察了薄膜的表面结构[12]。
1.3.3 傅里叶变换红外光谱
在4000~400 cm−1范围内使用衰减全反射红外光谱对膜样品进行扫描[14],光谱在4 cm−1分辨率下获得。
1.3.4 机械性能
薄膜的拉伸强度(TS)和断裂伸长率(EAB)通过一些修改[15]来适应样品。采用TA-XT Plus质地分析仪的A/TG探针分析。膜被切割成40 mm长和10 mm宽的样品进行测试。
1.3.5 透光率
根据Jiang等[12]的研究结果,采用比色法测定薄膜的透光率。将膜裁剪成比色皿规格(1.0×4.0 cm)的条状,紧贴在比色皿内侧,用空比色皿作对照,在600 nm下测定膜的透光率。
1.3.6 水蒸气透过率
对Jiang等[16]的方法进行修改后,在25 ℃、50% RH的恒温恒湿箱中测量薄膜的水蒸气透过率(WVP),每2 h记录称量瓶重量的变化,时长10 h,结果用g·s−1m−1Pa−1表示。
1.4 数据处理
每项测定至少重复三次。数据用均值±标准差表示,用SPSS 25软件进行方差分析(ANOVA)和用Duncan's显著性分析,用Origin 8.5作图。
2. 结果与分析
2.1 WPC和EWP质量比对复合膜结构和性能的影响
薄膜的微观结构以及结构中可能存在的间隙和裂纹采用扫描电子显微镜技术研究。五种膜的表面形态图如图1所示,从图1中可以看出,WPC单一膜表面有较多孔隙和少量裂缝产生,EWP单一膜有少量聚集体,而当WPC和EWP质量比为1:1和1:3时,WPC/EWP复合膜的表面比WPC单一膜和EWP单一膜表面光滑且没有缝隙,结构致密,表明WPC和EWP具有很好的相容性,能够有效阻止水蒸气的透过。在Dong等[17]的研究中发现,利用蛋清蛋白对小麦面筋蛋白改性后,复合膜的表面比小麦面筋单一膜光滑。
红外光谱对薄膜的理化性质有直接影响,反映了薄膜中聚合物之间的相互作用,如图2所示。出现在3300~3200 cm−1的峰属于O-H的伸缩振动,受分子内和分子间氢键的影响。在2950~2900 cm−1的峰和C-H的伸缩振动有关。在1700~1600 cm−1范围内的峰是酰胺1带中C=O的伸缩振动,和蛋白质二级结构相关。在1550~1500 cm−1范围内的峰是酰胺Ⅱ带中N-H的弯曲振动[18]。与WPC单一膜相比,随着EWP的加入,WPC/EWP膜的O-H带、C-H带及酰胺Ⅰ带的吸收峰向高波数移动,而酰胺Ⅱ带的吸收峰向低波数移动。这说明振动基团所需的能量增加,复合膜基团之间更加稳定和相容[19]。和复合膜抗拉强度增加的结果一致,膜的表面结构也更加致密。从图2中可以看出红外光谱没有检测到复合膜官能团的显著变化,这支持了之前的观点,非共价相互作用(例如氢键和范德华力)被认为是膜组分连接的主要驱动力[20]。
表1为WPC和EWP质量比对复合膜厚度、水蒸气透过率、透光率、抗拉强度和断裂伸长率的影响。在可食膜的制备过程中,成膜材料的质量比对复合膜的厚度有较大影响[21]。如表1所示,随着EWP质量的增加,各组之间膜的厚度无明显的变化规律,但随着EWP的增加复合膜的厚度略微下降。随着EWP含量的增加,WPC/EWP复合膜的抗拉强度和断裂伸长率均呈现先增加后下降的趋势。当WPC和EWP质量比为1:3时,WPC/EWP复合膜的抗拉强度为3.46 MPa,断裂伸长率为129.87%,达到最大值(P<0.05)。这是由于加热使蛋白质分子内部的二硫键、氢键等暴露出来[22],在TG酶的催化作用下,蛋白链间发生更强烈的作用,分子间作用增强,形成了更加致密的网络结构,进而导致了WPC/EWP复合膜抗拉强度和断裂伸长率的增加。Huang等[23]研究发现,随着蛋清蛋白质量的增加,蛋清蛋白/κ-卡拉胶的抗拉强度下降,断裂伸长率呈现先增加后减小的趋势,原因是蛋清蛋白的加入改变了复合膜的空间结构[24]。从表1中可以看出,与WPC和EWP单一膜相比,复合膜的透光率达到最大值为72.2%(P<0.05),说明WPC和EWP在比例为1:3时相容性较好。
表 1 WPC/EWP质量比对复合膜阻隔性能和机械性能的影响Table 1. Effects of WPC/EWP mass ratio on barrier and mechanical properties of composite filmsWPC/EWP 厚度(mm) 水蒸气透过率×10−10(g·s−1m−1Pa−1) 透光(%) 抗拉强度(MPa) 断裂伸长率(%) WPC 0.175±0.008a 3.44±0.32b 59.73±2.06c 1.85±0.22c 54.72±12.57c 3:1 0.170±0.007a 3.43±0.23b 60.50±4.88c 2.00±0.59bc 86.28±18.17b 1:1 0.156±0.096a 3.16±0.47bc 65.17±3.31bc 2.69±0.36b 111.55±21.09b 1:3 0.159±0.011a 2.72±0.40c 72.20±4.25a 3.46±0.48a 129.87±10.34a EWP 0.158±0.008a 4.10±0.06a 70.90±0.50b 2.39±0.33bc 105.26±19.29b 膜的水蒸气透过率随着EWP质量的增加呈现先下降后上升的趋势,且在WPC和EWP质量比为1:3时,复合膜的水蒸气透过率达到最小值(2.72×10−10/g·s−1m−1Pa−1)(P<0.05)。原因可能是随着EWP含量的增加,WPC和EWP之间形成了静电相互作用,促进了电荷的抵消[25]。当WPC和EWP质量比为1:3时,由上述电镜图可知WPC/EWP复合膜结构致密,表现出更好的疏水特性,进而限制了聚合物链的迁移降低了水蒸气透过率。在Tavares等[25]研究中发现,在乳清分离蛋白中加入壳聚糖后,复合膜的水蒸气透过率降低。
2.2 膜液pH对WPC/EWP复合膜结构和性能的影响
图3是不同成膜液pH对WPC/EWP复合膜表面结构的影响。从图中可以看出,当成膜液pH为6时,复合膜表面有较大聚集体产生且复合膜表面不光滑,原因可能是此pH接近蛋白质的等电点[26],导致蛋白质变性严重,进而在膜干燥过程中产生了较大的聚集体。随着成膜液pH的增加,WPC/EWP复合膜表面的聚集体减少且逐渐光滑,当pH为9时,WPC/EWP复合膜的表面最光滑且无孔隙。
成膜液的pH可以影响蛋白质表面电荷进而影响了蛋白质分子之间的相互作用以及膜的性能[27]。表2是成膜液pH对WPC/EWP复合膜厚度、水蒸气透过率、透光率、抗拉强度及断裂伸长率的影响。
表 2 pH对WPC/EWP复合膜阻隔性能、机械性能的影响Table 2. Influence of pH on barrier and mechanical properties of WPC/EWP composite films样品 厚度(mm) 水蒸气透过率×10−10(g·s−1m−1Pa−1) 透光率(%) 抗拉强度(MPa) 断裂伸长率(%) C-pH6 0.182±0.009a 4.13±0.29a 53.40±1.14b 1.19±0.44b 107.55±18.05b C-pH7 0.176±0.003b 3.87±0.55ab 71.10±0.70ab 1.30±0.27b 171.99±20.40a C-pH8 0.167±0.006b 2.99±0.71b 73.00±1.68a 1.88±0.09a 182.86±20.77a C-pH9 0.179±0.003a 3.32±0.33ab 69.97±1.87b 1.27±0.11b 154.57±48.72ab C-pH10 0.182±0.003a 3.82±0.41ab 71.07±0.86ab 1.29±0.10b 164.49±26.60a 从表2可以看出,成膜液pH对WPC/EWP复合膜的厚度影响较小,但在成膜液pH为8时,复合膜的厚度达到最小值为0.167 mm。WPC/EWP复合膜的抗拉强度和断裂伸长率随着成膜液pH的增加呈现先增加后下降的趋势,当成膜液pH为8时,WPC/EWP复合膜的抗拉强度为1.88 MPa,断裂伸长率为182.86%。当pH增加到8后,蛋白质的电荷发生改变,蛋白质暴露出更多的疏水或巯基等活性基团[27],使WPC和EWP的相互作用增大。然而成膜液pH继续增大到9和10后,由于蛋白质的碱水解作用和TG酶的活性下降,破坏了复合膜的致密结构,使蛋白质的网络结构疏散,进而造成了抗拉强度和断裂伸长率的降低以及水蒸气透过率的增大。
由表2可知,WPC/EWP复合膜的透光率随成膜液pH的增加没有明显变化趋势,但当pH为8时,复合膜的透光率为73.0%为最大值(P<0.05),表明WPC和EWP具有较好的相容性。在张轩等[26]的研究中发现了相似的结果。WPC/EWP复合膜的水蒸气透过率随着pH的增加呈现先减少后增加的趋势,当成膜液pH为8时,WPC/EWP复合膜的水蒸气透过率最小(2.99×10−10 g·s−1m−1Pa−1)。说明在此pH,WPC和EWP具有较强的相互作用,形成了致密的网络结构,有效阻止了水分子的渗透。然而在辛颖等[28]的研究中发现,成膜液pH对乳清蛋白膜的水蒸气透过率没有显著影响,但透氧率呈现先减少后增加的趋势。
2.3 甘油添加量对复合膜性能的影响
在增塑剂存在的情况下,蛋白质的热处理会导致蛋白质的展开、不可逆变性和相互作用,形成蛋白质和增塑剂的复杂固体网络[29]。由于蛋白质分子键的刚性作用,膜较脆,常添加甘油来改变膜的特性。从表3可以看出,WPC/EWP复合膜的厚度随着甘油添加量的增加呈现增大的趋势,而WPC/EWP复合膜的抗拉强度随着甘油添加量的增加由2.65 MPa下降至0.66 MPa,而断裂伸长率呈现一个增加的趋势,当甘油添加量为55%时,复合膜的断裂伸长率达到185.09%。甘油添加到大分子聚合物中,形成氢键,减少分子内部的氢键作用,同时削弱了蛋白质分子间的范德华力,分子链之间的空隙增加,软化了复合膜的刚性结构,柔韧性增加进而使膜的断裂伸长率增加[30]。在制备条件对大豆分离蛋白-淀粉复合膜机械性能的影响中发现了相似的趋势[31]。复合膜的透光率随着甘油添加量的增加呈下降趋势,在Huntrakul等[32]的研究中发现添加甘油作为增塑剂的膜有较低的透光率。
表 3 甘油添加量对WPC/EWP复合膜阻隔性能、机械性能的影响Table 3. Effects of glycerin addition on barrier properties and mechanical properties of WPC/EWP composite films样品 厚度(mm) 水蒸气透过率×10−10(g·s−1m−1Pa−1) 透光率(%) 抗拉强度(MPa) 断裂伸长率(%) C-25 0.151±0.001e 1.22±0.01e 74.90±1.21a 2.65±0.73a 80.91±13.66b C-35 0.159±0.002d 2.08±0.10d 73.90±0.56ab 1.60±0.27b 151.96±23.45a C-45 0.177±0.001c 3.51±0.15c 72.17±2.39bc 1.21±0.14bc 174.06±8.53a C-55 0.184±0.003b 4.56±0.38b 73.27±0.83ab 1.03±0.07bc 185.09±16.36a C-65 0.195±0.003a 5.62±0.06a 70.93±0.93c 0.66±0.05c 165.14±23.55a 由表3可知,水蒸气透过率随甘油添加量的增加呈现增大的趋势,这是由于添加甘油后,成膜基质内的分子变得比较柔软,分子内非结晶区增多,自由度变大,导致水蒸气容易透过薄膜。当甘油添加到成膜液中时,破坏了大分子之间的结构,进而导致WPC和EWP之间的相互作用降低,分子间间隙变大造成了水蒸气透过率的增加[30]。在不同增塑剂对大豆分离蛋白膜透气性的影响中发现,随着甘油质量分数的增加透气性增加[33]。
综合考虑WPC/EWP复合膜的厚度、水蒸气透过率及机械性能和膜的形态,选择甘油添加量为35%较为合适。
3. 结论
本文以WPC和EWP为成膜基质、甘油为增塑剂、TG酶作为交联剂进行WPC/EWP复合膜的制备与性能研究,探明了WPC和EWP质量比、成膜液pH、及甘油添加量对膜性能的影响。研究表明WPC/EWP复合膜的适宜成膜条件为WPC/EWP质量比1:3,成膜液pH8,甘油添加量35%,在适宜制备条件下WPC/EWP复合膜结构致密、WPC和EWP之间形成了静电相互作用,具有良好的机械性能和阻隔性能,显示出开发应用潜能。本研究为WPC/EWP复合膜的实际开发应用提供了理论指导,在后续研究工作中应进一步深入研究该复合膜的在食品包装方面的适宜途径和实际应用性能。
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表 1 WPC/EWP质量比对复合膜阻隔性能和机械性能的影响
Table 1 Effects of WPC/EWP mass ratio on barrier and mechanical properties of composite films
WPC/EWP 厚度(mm) 水蒸气透过率×10−10(g·s−1m−1Pa−1) 透光(%) 抗拉强度(MPa) 断裂伸长率(%) WPC 0.175±0.008a 3.44±0.32b 59.73±2.06c 1.85±0.22c 54.72±12.57c 3:1 0.170±0.007a 3.43±0.23b 60.50±4.88c 2.00±0.59bc 86.28±18.17b 1:1 0.156±0.096a 3.16±0.47bc 65.17±3.31bc 2.69±0.36b 111.55±21.09b 1:3 0.159±0.011a 2.72±0.40c 72.20±4.25a 3.46±0.48a 129.87±10.34a EWP 0.158±0.008a 4.10±0.06a 70.90±0.50b 2.39±0.33bc 105.26±19.29b 表 2 pH对WPC/EWP复合膜阻隔性能、机械性能的影响
Table 2 Influence of pH on barrier and mechanical properties of WPC/EWP composite films
样品 厚度(mm) 水蒸气透过率×10−10(g·s−1m−1Pa−1) 透光率(%) 抗拉强度(MPa) 断裂伸长率(%) C-pH6 0.182±0.009a 4.13±0.29a 53.40±1.14b 1.19±0.44b 107.55±18.05b C-pH7 0.176±0.003b 3.87±0.55ab 71.10±0.70ab 1.30±0.27b 171.99±20.40a C-pH8 0.167±0.006b 2.99±0.71b 73.00±1.68a 1.88±0.09a 182.86±20.77a C-pH9 0.179±0.003a 3.32±0.33ab 69.97±1.87b 1.27±0.11b 154.57±48.72ab C-pH10 0.182±0.003a 3.82±0.41ab 71.07±0.86ab 1.29±0.10b 164.49±26.60a 表 3 甘油添加量对WPC/EWP复合膜阻隔性能、机械性能的影响
Table 3 Effects of glycerin addition on barrier properties and mechanical properties of WPC/EWP composite films
样品 厚度(mm) 水蒸气透过率×10−10(g·s−1m−1Pa−1) 透光率(%) 抗拉强度(MPa) 断裂伸长率(%) C-25 0.151±0.001e 1.22±0.01e 74.90±1.21a 2.65±0.73a 80.91±13.66b C-35 0.159±0.002d 2.08±0.10d 73.90±0.56ab 1.60±0.27b 151.96±23.45a C-45 0.177±0.001c 3.51±0.15c 72.17±2.39bc 1.21±0.14bc 174.06±8.53a C-55 0.184±0.003b 4.56±0.38b 73.27±0.83ab 1.03±0.07bc 185.09±16.36a C-65 0.195±0.003a 5.62±0.06a 70.93±0.93c 0.66±0.05c 165.14±23.55a -
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