Effects of Different Treatments on the Structure and Physicochemical Properties of Artichoke Dietary Fiber
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摘要: 本实验以洋蓟膳食纤维(ADF)为原料,探究超微粉碎和低温冷冻-超微粉碎两种处理方法对洋蓟膳食纤维的结构及理化性质的影响。结果表明,通过结构表征发现低温冷冻-超微粉碎使洋蓟膳食纤维结构更加疏松,颗粒大小均匀、集中。结合相关计算证实,与普通粉碎相比,超微粉碎和低温泠冻-超微粉碎的D50分别减小了84.63%和86.72%,膨胀力、持水力和持油力分别提升了1.22、1.20、1.06倍和1.44、1.25、1.97倍,葡萄糖吸收能力分别提升了135.09%和271.09%,普通粉碎、超微粉碎和低温冷冻-超微粉碎的结晶度分别为26.73%、30.57%、38.10%。超微粉碎和低温冷冻-超微粉碎均可改善洋蓟膳食纤维的理化性质,并且低温冷冻-超微粉碎处理后的提升更显著,为未来洋蓟膳食纤维的综合利用提供了一些新思路。Abstract: The effects of two treatments–ultrafine grinding (UG) and freeze-ultrafine-grinding (FUG) on the structure and physicochemical properties of artichoke dietary fiber as dietary fiber (ADF) were investigated. The results showed that the structure of the freeze-ultrafine-grinding artichoke dietary fiber was looser and the particle size was more uniform and concentrated. Compared with non-treated ADF, the D50 values were reduced by 84.63% and 86.72% respectively for the two treatments. In addition, the swelling power, the water holding capacity and the oil holding capacity of the two treatments were increased by 1.22, 1.20, 1.06 times and 1.44, 1.25, 1.97 times, respectively. Moreover, the glucose absorption capacity were increased by 135.09% and 271.09%. And beyond that, the crystallinity of non-treated ADF, UG and FUG were 26.73%, 30.57% and 38.10%. Both UG and FUG improved the physicochemical properties of artichoke dietary fiber, with the latter one being more effective. This study would provide new ideas for the comprehensive utilization of artichoke dietary fiber in the future.
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Keywords:
- artichokes /
- dietary fiber /
- freezing /
- ultrafine grinding /
- physicochemical properties
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洋蓟,别名朝鲜蓟、法国洋蓟、球洋蓟、法国百合等,是一种菊科菜蓟属植物,在我国云南、浙江、湖南等地相继引种并形成规模化种植[1]。洋蓟的主要食用部位是绿色叶状苞片包围的花蕾,具有很高的营养价值,同时叶柄软化后也可水煮食用[2]。食用新鲜洋蓟的花蕾可保护肝肾、增强肝脏排毒、促进氨基酸代谢、降低胆固醇以及治疗消化不良、改善胃肠功能、防止动脉硬化、保护心血管[3-4]。宋曙辉等[5]研究发现,洋蓟花托、茎和叶片纤维含量较高,粗纤维含量以鲜样计,不可食用部分占4.41%,花托为0.73%,苞片可食部为2.65%,具有很高的营养保健功能。
洋蓟中的膳食纤维为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)和不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber,IDF)[6]。SDF具有更广泛和重要的生理功能,不仅可以显著影响碳水化合物和脂质的代谢,还可以吸附重金属离子和胆固醇,是影响膳食纤维生理功能的重要因素[7-9]。董吉林等[10]研究发现燕麦膳食纤维对食源性肥胖小鼠有显著降脂减肥的作用,其中SDF的效果更佳。美国流行病学研究显示,增加膳食纤维,尤其是SDF的摄入可降低冠心病发生风险[11]。洋蓟中膳食纤维的含量丰富但大多数是IDF,IDF口感粗糙且人体不易吸收,主要促进肠道蠕动等等发挥作用,这限制了洋蓟膳食纤维更好地发挥其功能[12-13]。因此,如何提高洋蓟膳食纤维的SDF含量已成为当下研究的热点。
低温冷冻是将物料冷却至玻璃化转变温度或低于脆化温度。作为预处理方法,低温冷冻与粉碎相结合,除了广泛应用于粉碎橡胶、塑料外,还可应用于粉碎食品,香料等。Liu等[14]研究发现低温粉碎使胡椒粉品质更佳、味道浓厚细腻。李杨等[15]在−4 ℃下将生物酶法制油豆渣膳食纤维经低温超微粉碎处理后,豆渣膳食纤维粒径分布稳定,其持水性、膨胀性显著提高。
超微粉碎是一种具有高速、污染少、原料利用率高等特点的新型加工方法[16],经超微粉碎后的食品颗粒粒径细小、均匀、易于发酵、酶解[17-18]。施建斌等[19]比较麦麸及麦麸膳食纤维分别在常规粉碎和超微粉碎后的物化特性,发现超微粉碎处理可进一步提升麦麸膳食纤维的持水性和持油性,超微粉碎麦麸及麦麸膳食纤维胆酸钠吸附量和葡萄糖吸附量明显上升等等,可以说明超微粉碎将有助于改变麦麸及麦麸膳食纤维的原始特性。Yan等[20]用高静水压(HHP)和超微粉碎处理(SFGT)对梨果渣的理化和功能特性的影响,结果表明,HHP和SFGT均可增加SDF含量。
湖南常德西洞庭管理区自2005年从国外引进洋蓟种植并加工成罐头出口外销,2015年,种植面积达到2000 hm2,单产7500 kg/hm2,然而目前西洞庭洋蓟加工罐头仅利用其合格鲜果的约1/3,洋蓟的综合利用率只有5%~10%,导致资源浪费和环境污染[21]。目前国内外对于超微粉碎在食品中的应用以及洋蓟的抗氧化成分、洋蓟粉等相关加工工艺等的研究较多,低温冷冻-超温粉碎和洋蓟膳食纤维鲜有研究,而洋蓟中膳食纤维的含量丰富且为优质纤维。为了更好地探究低温冷冻及超微粉碎两种方法相结合所产生的协同作用、提高洋蓟的资源利用率,本实验以洋蓟膳食纤维为原料,对比研究普通粉碎、超微粉碎和低温冷冻-超微粉碎三种处理方式对洋蓟膳食纤维结构及理化性质的影响,为提高洋蓟膳食纤维的综合利用提供新思路和理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
洋蓟 惠美农业科技有限公司;二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、无水乙醇、石油醚、氢氧化钠、盐酸、溴化钾、葡萄糖、氯化氢、硝酸银、氯化钠等试剂 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
JL-1178型激光粒度分析仪 成都精新粉体仪器有限公司;FA1104分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;FW-400A万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;SHA-C恒温震荡水浴锅 常州国华电器有限公司;SU8000冷场发射扫描电镜 日本日立公司;CJM-SY-B1型高能纳米冲击磨 秦皇岛市太极环纳米制品有限公司;DW-HL388超低温冰箱 中科美菱低温科技有限公司;smarlab ragiku 2019衍射仪 日本理学电机公司;MS400加热型磁力搅拌器 上海般特仪器制造有限公司;UV-1800紫外可见分析光度计 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 洋蓟预处理
取一定量干洋蓟花苞于105 ℃干燥12 h,取出冷却至室温后用万能粉碎机粉碎。粉碎后将样品用85%乙醇溶液按每克试样10 mL的比例冲洗后弃乙醇溶液,连续冲洗3次,再将试样置40 ℃烘箱内干燥12 h。干样粉碎过60目筛后得到脱糖洋蓟粉,置于玻璃干燥器中备用。
1.2.2 洋蓟膳食纤维的提取
准确称取脱糖洋蓟粉试样5 g(精确至0.01 g),加入水200 mL,用磁力搅拌直至试样完全分散在水中。调节pH6.0,向试样中先添加0.9 %热稳定a-淀粉酶在温度85 ℃、pH6下水解50 min。再添加0.9%蛋白酶,在温度55 ℃、pH6下水解40 min。水解完成后向每份试样酶解液中按乙醇与试样液体积比4:1的比例加入预热至(60±1) ℃的95%乙醇,加盖铝箔于室温条件下沉淀1 h后抽滤,在105 ℃烘干12 h后室温冷却1 h,得到洋蓟膳食纤维。
1.2.3 普通粉碎处理
将洋蓟膳食纤维放入万能粉碎机粉碎,过60目筛后收集。
1.2.4 超微粉碎处理
将洋蓟膳食纤维加入纳米冲击磨中,样品与锆球质量比2:1的条件下粉碎8 h,过300目筛后收集。
1.2.5 低温冷冻-超微粉碎处理
将洋蓟膳食纤维在−80 ℃下冷冻48 h,再加入纳米冲击磨中,样品与锆球质量比2:1的条件下粉碎8 h,过300目筛后收集。
1.2.6 粒径测定
采用激光粒度分析仪对洋蓟膳食纤维粉末粒径进行测定[22]。用空气作为分散剂,取适量的洋蓟膳食纤维,超声辅助使其分散均匀,设定折射率1.510,介质折射率1.33,粒径测定范围0.01~2000 μm。粒径分布的参数例如D10、D50、D90和粒度分布宽度等等,以Zhao等[23]的方法为参考,粒度分布宽度的换算如下:
span=(D90−D10)D50 式中:D10指样品的累计粒度分布百分数达到10 %时所对应的粒径;D50指样品的累计粒度分布百分数达到50%时所对应的粒径;D90指样品的累计粒度分布百分数达到90%时所对应的粒径。
1.2.7 傅里叶红外光谱(FTIR)
在充分干燥的环境中,取2 mg干燥的样品,加入200 mg充分干燥的溴化钾粉末于玛瑙研钵中,研磨直至完全研细混匀,将研磨好的粉末均匀加入压膜器内,压片5 min,然后迅速取出放入仪器中进行扫描,扫描波数400~4000 cm−1,扫描次数32次,扫描分辨率4 cm−1。
1.2.8 扫描电镜观察微观结构
取少量导电胶将适量干燥样品固定在样品台上,喷金100 s,将电镜的加速电压逐步从低到高升到5 kV,工作距离10 mm,分别放大2000、10000和20000倍观察样品颗粒的形貌,拍照分析样品形态变化。
1.2.9 理化性质分析
参考徐驱雾[22]的方法加以修改,测定样品的膨胀力、持水力、持油力、结合水力。
1.2.9.1 膨胀力(SWC)测定
精确称取洋蓟膳食纤维干样0.1 g(精确至0.001 g)于盛有一定蒸馏水的量筒中,混合均匀后于室温下放置24 h,观察样品在量筒中的自由膨胀体积(mL),计算其膨胀性。膨胀性换算成每克干物质的膨胀体积:
SWC(mL/g)=L1−L2m 式中:L1为膨胀后体积;L2为干样体积;m为样品干重。
1.2.9.2 持水力(WHC)测定
精确称取洋蓟膳食纤维干样0.5 g(精确至0.001 g)于50 mL离心管中,加30 mL蒸馏水浸泡摇匀,室温下静止1 h,在3000 r/min下离心20 min,弃上清液,称剩余沉淀物的重量。持水力换算成每克干物质中的水分含量:
WHC(g/g)=m2−m1m1 式中:m1为样品干重;m2为样品湿重。
1.2.9.3 持油力(OHC)测定
称取洋蓟膳食纤维干样0.1 g(精确至0.001 g)于试管中,加入一定量市售饱和色拉油混匀静置30 min后,倒置试管沥干多余油脂,然后称重,持油力换算成每克干物质所滞带的色拉油的重量:
OCH(g/g)=m2−m1m1 式中:m1为样品干重;m2为样品湿重。
1.2.9.4 结合水力(WBC)测定
精确称取洋蓟膳食纤维样品0.1 g(精确至0.001 g),浸泡于25 mL 25 ℃的蒸馏水中,伴随适当搅拌保持2 h。在14000 r/min条件下离心1 h后去除上清液,沉淀物静置于G-2多孔玻璃上1 h后称重。随后在120 ℃下干燥2 h再次称重,两者差值为所结合水的重量,结合水力换算成每克干物质的结合水克数:
WBC(g/g)=m2−m3m1 式中:m1为样品干重;m2为离心后样品湿重;m3为干燥后样品干重。
1.2.10 葡萄糖吸附能力测定
参考阮传英等[24]的方法,准确称取1.00 g样品(精确至0.001 g)放入100 mL 100 mmol/L的葡萄糖溶液(pH7.0)中。在38 ℃下磁力搅拌7 h。然后3000 r/min下离心25 min,利用可见分光光度法在505 nm下测定上清液中葡萄糖含量,同时做空白对照:
吸附量(mg/g)=溶液中葡萄糖总量−上清液中葡萄糖含量样品质量 1.2.11 XRD分析
将样品在45 ℃下干燥4 h,然后使用衍射仪在25 ℃下以0.2 s/步扫描并记录XRD图谱(其中管电流:150 mA,管电压:40 kV,DS狭缝0.5°,SS狭缝0.5°,RS狭缝0.1 mm,CuKα辐射,λ=0.1540 nm,2θ=3.2°至80°的范围内)。洋蓟膳食纤维的相对结晶度(CI)计算方式如下:
CI(%)=A结晶A非晶态+A结晶×100 式中:
A非晶态 为非晶态曲线下的面积;A结晶 为采样曲线下的区域。使用Scherrer方程确定纤维素尺寸:
L=kλ/βcosθ 式中:λ=0.1540 nm;k为校正因子且k=0.91;弧度θ 为衍射角;β 为全宽。
纤维素的d间距用布拉格定律确定:
d=nλ(2sinθ) 式中:d为晶格平面之间的面间距离;θ为以度为单位的散射角;n为正整数;λ为x射线的波长。
1.3 数据处理
所有实验平行3次,采用Microsoft excel 2016处理数据,Origin 2018作图,结果均采用平均值±标准差(
ˉx ±s)的形式表示,通过SPSS 22.0进行分析数据,采用方差分析和T检验,P<0.05有显著差异,P<0.01有极显著差异。2. 结果与分析
2.1 不同处理方法对洋蓟膳食纤维粒径的影响
如表1所示,与普通粉碎相比,超微粉碎和低温冷冻-超温粉碎处理后的洋蓟膳食纤维的粒度显著减小,其中低温冷冻-超微粉碎膳食纤维不仅D50最小,而且粒度分布宽度小于其他两种,说明其粒径大小分布从杂乱逐渐变得集中,这可能与DF颗粒受到剪切力,纤维素结构受到一定程度的破坏有关,从而影响DF的功能特性,这与Zhao等[23]得到的结论一致。
表 1 不同处理方式对洋蓟膳食纤维粒度和分布的影响Table 1. Effects of different treatments on grain size and distribution of artichoke dietary fiber样品 D10(µm) D50(µm) D90(µm) 粒度分布宽度 普通粉碎 24.63±0.45a 184.06±5.47a 713.97±2.81a 3.75±0.10b 超微粉碎 7.59±0.85b 28.29±1.26b 138.11±6.16b 4.61±0.02a 低温冷冻-超微粉碎 6.54±0.16c 24.45±0.75c 91.84±9.21c 3.49±0.39c 注:同一列不同字母表示不同样品间差异显著(P<0.05)。 2.2 不同处理方法的洋蓟膳食纤维傅里叶红外光谱分析
如图1所示,红外光谱图中波数3367 cm−1附近的吸收峰为分子内羟基(-OH)伸缩振动峰,这是由于分子间氢键发生缔合,低温冷冻-超微粉碎后的洋蓟膳食纤维的峰明显比其他两组宽且峰强度有所上升,主要是由样品中果胶和半纤维素引起的。波数为2943 cm−1的峰为C-H伸缩振动峰,是多糖类物质典型结构特征,其中低温冷冻-超温粉碎的洋蓟膳食纤维的峰强度最大,说明亚甲基含量最多。1732 cm−1的峰归属于羰基(C=O)的伸缩振动峰,波数为1058 cm−1的峰为C-O的伸缩振动峰,这主要是由半纤维素引起的,同时也说明了样品可能含有酯基,1639 cm−1为吸附水的H-O-H弯曲振动峰,在低温冷冻-超微粉碎后的洋蓟膳食纤维中强度最大,说明此样品吸水性最大,1325 cm−1峰归属于脂肪族不对称的C-H键弯曲振动峰,1247 cm−1峰为纤维素中C-O伸缩振动峰,在1527 cm−1附近没有木质素的特征吸收峰出现,说明三组样品都不含木质素[25]。从图1中各官能团的峰可以看出,低温冷冻-超微粉碎>超微粉碎>普通粉碎,整体分析可知,低温冷冻-超微粉碎处理前后洋蓟膳食纤维具有-OH、C-H、C=O、C-O键等果胶、多糖类、纤维素及半纤维素的特征吸收峰,没有出现新吸收峰,其特征吸收峰峰型、位置及峰数量均未有明显变化,说明与普通粉碎相比,经过超微粉碎和低温冷冻-超微粉碎后的洋蓟膳食纤维的理化性质提升但化学成分均未发生明显变化,其中低温冷冻-超微粉碎使洋蓟膳食纤维的理化性质提升更明显。
如图2所示,与其他方法相比,低温冷冻-超微粉碎使洋蓟膳食纤维表面结构发生了较大的变化。在2000倍数下,横向对比可以看出超微粉碎的颗粒多为不规则片状结构,普通粉碎和低温冷冻超微粉碎呈块状排列。再通过观察10000和20000倍,三种方法对比后发现超微粉碎和冷冻低温-超微粉碎的组织结构变得疏松,其中低温冷冻-超微粉碎的膳食纤维受到更强烈的机械剪切作用,比表面积明显增大,纤维内部结构受到破坏使更多亲水基团外露,持水力、持油力、膨胀力提高,这与李天等[26]得到的结论一致。
2.3 不同处理方法对洋蓟膳食纤维理化性质的影响
洋蓟膳食纤维具有良好的持水性、持油性、膨胀力和结合水力等,这与其结构组成密切相关,能进一步反映其功能特性。表2为不同处理方法的洋蓟膳食纤维的理化性质及持油力的变化。分析表2可知,经过超微粉碎的洋蓟膳食纤维的膨胀力、持水力和持油力有明显提高,但低温冷冻-超微粉碎的提高更显著,与普通粉碎的洋蓟膳食纤维相比分别提升了1.44、1.25、1.97倍。由于粉碎后颗粒数量增加,膳食纤维颗粒溶于水后容积增大,膳食纤维的膨胀力增大,而粉碎使物料粒度减小,孔隙率相对增加,更多的亲水性基团暴露,从而膨胀力上升[27-29]。超微粉碎和低温冷冻-超微粉碎均使可溶性膳食纤维占比增加,导致膨胀力大幅提高[28。因为膳食纤维大分子结构被破坏,影响了其整体的理化性质,反而使其对小分子的吸附性变强;粉碎对膳食纤维产生空穴效应和剪切力,颗粒的增多会使得比表面积增大,更易结合油脂,所以低温冷冻-超微粉碎条件下的持油力更大,这与李菁等[29]得到的结论一致。但随着进一步细化,尤其在低温冷冻-超微粉碎处理后,洋蓟膳食纤维的结合水力更显著下降,可能是粉碎过程中,机械作用破坏颗粒毛细结构部分、纤维基质以及致密的多孔网状结构,原本通过氢键存留在多孔网状结构内部空隙间的水分被释放,对水的束缚减小,低温冷冻使得网状结构破坏强度更大,对水的束缚更小,最终导致结合水力下降[30-31]。
表 2 不同处理方法的洋蓟膳食纤维的理化性质Table 2. Physicochemical properties of dietary fiber from artichoke with different treatment methods样品 膨胀力(mL/g) 持水力(g/g) 结合水力(g/g) 持油力(g/g) 普通粉碎 4.82±0.03c 4.98±0.03c 4.07±0.02b 2.58±0.05c 超微粉碎 5.88±0.05b 5.96±0.05b 4.33±0.03a 4.25±0.05b 低温冷冻-超微粉碎 6.95±0.03a 6.23±0.03a 3.89±0.04c 5.07±0.03a 注:同一列不同字母表示不同样品间差异显著(P<0.05)。 2.4 不同处理方法对洋蓟膳食纤维葡萄糖吸附能力的影响
在100 mmol/L的葡萄糖溶液浓度条件下,洋蓟膳食纤维对葡萄糖的等温吸附结果为普通粉碎0.57±0.03 mg/g、超微粉碎1.34±0.04 mg/g、低温冷冻-超微粉碎2.12±0.04 mg/g。由图3可见,经过低温冷冻-超微粉碎的洋蓟膳食纤维对葡萄糖吸附能力是普通粉碎的3.7倍。超微粉碎使洋蓟膳食纤维的内部结构变疏松,颗粒之间的间隙使内部溶质进入纤维内部更加容易,同时网状结构被打开,变成片层状结构,其中的功能基团暴露,使葡萄糖吸附能力增强,而经过低温冷冻-超微粉碎后的洋蓟膳食纤维因低温冷冻使功能基团暴露更加彻底,比起超微粉碎处理吸附能力更强。微观结构不是影响吸附作用的唯一因素,洋蓟膳食纤维本身的性质也会影响其吸附能力[32]。而普通粉碎后的洋蓟膳食纤维结构比其他两种方法处理后更致密一些,包裹在内部的许多功能基团很难发挥吸附作用,这与扫描电镜的分析结果一致。
2.5 不同处理方法对洋蓟膳食纤维结晶度的影响
结晶度是衡量洋蓟膳食纤维物理特性的重要指标,随着结晶度的增加,材料的尺寸稳定性、抗拉强度、弹性模量、耐热性等特性随之增强。如图4所示,三种方法的XRD图谱都显示出相似的形状。X射线衍射图样记录在2θ=14.98°,22.8°和34.49°处,图谱中峰表示这三种方法处理后的洋蓟膳食纤维均具有纤维素 Ⅰ 型的X射线衍射曲线特征,说明晶体类型为纤维素Ⅰ型,为结晶区与非结晶区两相共存的状态[33]。纤维素是一种重要的不可溶性膳食纤维,主晶峰在22.8°处观察到强度为100%,证实了其中结晶纤维素的存在。经过计算,三个不同处理方法样品的结晶度,分别为1#=26.73%,2#=38.10%,3#=30.5%,可以看出低温冷冻-超微粉碎破坏了纤维素I型晶体中的无定形结构,并使得纤维素结构被破坏[34-35],从而导致持水力、膨胀力、持油力等理化性质的变化。
3. 结 论
利用三种不同的处理方式处理洋蓟膳食纤维,通过电镜观察,结合粒径的相关分析对比发现,低温冷冻-超微粉碎处理的洋蓟膳食纤维粒径分布更加集中和均匀,通过FTIR证实了低温冷冻-超微粉碎使洋蓟膳食纤维的理化性质更显著提升,通过观察XRD图谱发现低温冷冻-超微粉碎处理的洋蓟膳食纤维中的纤维素结构受到破坏,亲水基团暴露,使结晶能力和葡萄糖吸附能力显著提高,并且改善了持水力、膨胀力、持油力等理化性质,说明低温冷冻-超微粉碎可以很好地优化洋蓟膳食纤维的结构和物理特性。本研究仅仅在洋蓟膳食纤维层面对低温冷冻-超微粉碎的处理效果进行分析,有助于为未来洋蓟膳食纤维的综合利用和与超微粉碎相关的协同作用提供一些新思路。
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表 1 不同处理方式对洋蓟膳食纤维粒度和分布的影响
Table 1 Effects of different treatments on grain size and distribution of artichoke dietary fiber
样品 D10(µm) D50(µm) D90(µm) 粒度分布宽度 普通粉碎 24.63±0.45a 184.06±5.47a 713.97±2.81a 3.75±0.10b 超微粉碎 7.59±0.85b 28.29±1.26b 138.11±6.16b 4.61±0.02a 低温冷冻-超微粉碎 6.54±0.16c 24.45±0.75c 91.84±9.21c 3.49±0.39c 注:同一列不同字母表示不同样品间差异显著(P<0.05)。 表 2 不同处理方法的洋蓟膳食纤维的理化性质
Table 2 Physicochemical properties of dietary fiber from artichoke with different treatment methods
样品 膨胀力(mL/g) 持水力(g/g) 结合水力(g/g) 持油力(g/g) 普通粉碎 4.82±0.03c 4.98±0.03c 4.07±0.02b 2.58±0.05c 超微粉碎 5.88±0.05b 5.96±0.05b 4.33±0.03a 4.25±0.05b 低温冷冻-超微粉碎 6.95±0.03a 6.23±0.03a 3.89±0.04c 5.07±0.03a 注:同一列不同字母表示不同样品间差异显著(P<0.05)。 -
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