Separation, Purification, Structural Characterization and Antioxidation Effects of a Polysaccharide from Nervilia fordii
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摘要: 对水提醇沉获得的青天葵粗多糖进行分离纯化，并对多糖组分进行分析表征和体外抗氧化活性评价。结果表明，用DEAE-52纤维素及葡聚糖凝胶G-100柱色谱分离纯化出的多糖组分NFP-2分子质量为1150 kDa，总糖含量为82.64%，糖醛酸含量为16.65%，蛋白质含量为6.38%。NFP-2由半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸组成，摩尔比为21.27:13.21:5.26:3.02:2.82:1，其为不含三螺旋结构的酸性多糖，糖苷键构型为β-构型。体外清除自由基试验结果显示，NFP-2对羟基自由基（IC50 7.95 mg/mL）和超氧阴离子自由基（当浓度为0.5 μg/mL时，清除率为60%）均有明显清除作用；当NFP-2浓度为10 mg/mL时，ABTS阳离子自由基的清除率为35.44%；当NFP-2浓度为120 μg/mL时，DPPH自由基清除率为17%。Abstract: The crude polysaccharide from Nervilia fordii obtained by water extraction and ethanol precipitation was separated and purified, and the components of the polysaccharide were analyzed and characterized, and the antioxidant activity in vitro was evaluated. Results showed that: A polysaccharide, NFP-2 was purified by DEAE-52 cellulose and Sephadex G-100 column chromatography from the crude polysaccharides of Nervilia fordii obtained by water extraction and ethanol precipitation. The molecular weight of NFP-2 was determined to be 1150 kDa, and the total sugar content, the uronic acid content and the protein content of NFP-2 were measured to be 82.64%, 16.65% and 6.38%, seperately. It was measured that the NFP-2 was composed of galactose, arabinose, mannose, glucose, rhamnose, and galacturonic acid with their molar ratio of 21.27:13.21:5.26:3.02:2.82:1. And NFP-2 was an acidic polysaccharide without triple helix structure, its glycosidic bond configuration was β-configuration. Its antioxidation effects were tested by several assays in vitro, and it showed that the NFP-2 could scavenge hydroxyl radicals with IC50 7.95 mg/mL, the scavenging ability of the NFP-2 of 0.5 μg/mL on superoxide anion radicals was 60%, the scavenging ability of the NFP-2 of 10 mg/mL on ABTS cation free radicals was 35.44%, and the scavenging ability of the NFP-2 of 120 μg/mL on DPPH free radicals was 17%.
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青天葵为兰科植物毛唇芋兰Nervilia fordii （Hance） Schltr.的块茎和全草，别名独叶莲、珍珠草、独脚莲、珍珠叶等，主要分布于广东、广西、云南、四川等地[1-2]。在东南亚地区和我国两广地区，青天葵全草为民间习用的凉茶药材之一，也常与瘦肉炖汤食用，是岭南地区常用的具有清热润肺止咳、解毒散瘀止痛的药食两用的药材[3-4]。目前，研究者已从青天葵全草中分离得到黄酮[5-6]、萜类[7]、氨基酸和挥发油等一些小分子化合物。相关药理学研究证实这些化合物具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等活性[8]。
多糖又称为多聚糖，由多个单糖或单糖衍生物经过聚合生成的聚合度大于10的大分子化合物，主要分为植物多糖、动物多糖及微生物多糖[9]。植物多糖由于在增强免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎作用等方面具有良好的应用前景及来源广与无毒副作用的特性，越来越引起国内外研究者们的兴趣[10]。多糖的药理活性与多糖的一级结构如分子量、单糖组成、取代基种类和数目、支化度等有关，还与多糖的空间高级结构以及多糖的溶解度等多种因素有关。当多糖任一构成因素发生变化时，其药理活性可能会相应改变。
本课题组在前期研究中，采用水提醇沉法获得青天葵多糖，通过DEAE-52和葡聚糖凝胶G-100层析柱分离纯化了7个多糖组份。截至目前，本课题组已经报道了两个青天葵均一多糖（NFP-A4和NFP-1）的理化性质、结构表征及其免疫调节活性[11-12]。研究结果表明，这两个均一多糖无论分子量、单糖组成、取代基种类，还是药理活性都存在较大差异，体现了青天葵多糖化学结构和药理活性的多样性。因此，本文继续研究第三个多糖组分NFP-2的理化性质和结构表征，以及测定NFP-2对DPPH、羟基、ABTS阳离子、超氧阴离子等自由基的清除能力，为丰富青天葵多糖结构和活性探讨提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
青天葵全草 广西一心医药有限公司（产地为广西）；单糖标品（氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖） 美国Sigma公司；DEAE-52纤维素 上海恒信化学试剂有限公司；Sephadex G-100葡聚糖凝胶 Pharmacia Biotech公司；透析袋（分子截留量3500 Da） 美国Viskase公司；其余试剂 均为国产分析纯。
LC-20A高效液相色谱仪、mini-1240紫外可见光分光光度计 日本岛津公司；PerkinElmer One FT-IR傅里叶变换红外光谱仪 美国PerkinElmer公司；FD-1A-50型冷冻干燥器 北京博医康实验仪器有限公司；TDL-4型低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；SpectraMaxPlus384型连续光谱扫描式酶标仪 美国Molecular Devices公司；CQ 50型超声波水浴 上海超声波仪器厂；R-1001N型旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 青天葵总多糖样品的制备
取青天葵干燥全草，粉碎，过24目筛，得到粗粉。取800 g青天葵粉末，用10倍量蒸馏水加热回流提取2次，每次2 h，过滤，滤液用旋转蒸发仪50 ℃减压浓缩。用无水乙醇调节浓缩液至含乙醇量至80%，4 ℃冰箱静置24 h，离心，丢弃上清液，取沉淀；沉淀溶于适量去离子水中，Sevag法[氯仿:正丁醇=5:1（v/v）]除去游离蛋白，离心，取上清液，重复5次，冷冻干燥得到青天葵总多糖[13]。
1.2.2 青天葵总多糖的分离纯化
取青天葵总多糖20 g，加50 mL 60 ℃蒸馏水溶解后，然后在3500 r/min离心10 min，取上清液，缓慢滴加到活化且平衡后的DEAE-52层析柱上（φ3.6×45 cm），以蒸馏水、0.2、0.4、0.6、0.8和1.2 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱。每梯度洗脱液的洗脱体积约为1000 mL，每管收集20 mL，隔管检测490 nm（苯酚-硫酸显色后）下的吸光度，绘制洗脱曲线。通过洗脱曲线选取最佳洗脱峰，收集洗脱峰处的洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得到7个组分（DT-1~DT-7）。
取组分DT-2（0.9 g），加5 mL 60 ℃蒸馏水溶解后，3500 r/min离心10 min，取上清液，滴加到Sephadex G-100葡聚糖凝胶色谱柱上（φ1.2×25 cm），100 mL洗脱，2 mL/管收集流份。隔管检测490 nm（苯酚-硫酸显色后）下的吸光度值，绘制洗脱曲线，收集峰尖部分溶液，浓缩，透析，冷冻干燥得到样品（NFP-2）待分析。
1.2.3 青天葵多糖NFP-2的基本理化性质测定
1.2.3.1 NFP-2总糖含量测定
采用苯酚-硫酸法[14]，分别吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的葡萄糖对照品溶液于10 mL具塞试管中，补加蒸馏水至1.0 mL，各加入1.0 mL的5%苯酚溶液，涡旋混匀，立即加入5 mL的浓硫酸，反应20 min后，在490 nm处测定吸光度值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法测定吸光度值，根据标准曲线计算总糖含量。
1.2.3.2 NFP-2蛋白含量测定
采用Lowry法[15]，分别吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的牛血清蛋白（BSA）对照品溶液于10 mL具塞试管中，补加蒸馏水至1.0 mL，各加入5 mL碱式碳酸铜溶液，混合均匀，置于室温反应10 min后，加入0.5 mL福林酚试剂并放置30 min，显色后在650 nm处测定吸光度值。以BSA含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法测定吸光度值，根据标准曲线计算蛋白含量。
1.2.3.3 NFP-2糖醛酸含量测定
采用硫酸-咔唑法[16]，分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的半乳糖醛酸对照品溶液于10 mL具塞试管中，补加蒸馏水至1.0 mL，冰浴条件下各加入四硼酸钠-硫酸溶液5 mL，涡旋混匀，置于恒温水浴锅中加热煮沸20 min，取出后立即冰水冷却至室温，加入0.15%咔唑溶液，塞上塞子后，涡旋混匀，室温下保持2 h后于523 nm下测定吸光度。以半乳糖醛酸含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。取1.0 mL多糖溶液（1 mg/mL），按上述方法测定吸光度值，根据标准曲线计算糖醛酸含量。
1.2.4 NFP-2分子质量测定
根据文献[17]，利用高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatograph，HPGPC）测量均一多糖的分子质量。色谱条件如下：TSKgel G4000PWxl凝胶柱（7.8×300 mm，10 μm）；流动相1 mL/min三蒸水；柱温40 ℃；进样量10 μL；示差折光检测器。分别取10 μL 10 mg/mL系列Dextran标准葡聚糖溶液（分子质量分别为70、150、270、410、500、1100、2000 kDa）注入高效液相色谱仪，绘制其分子量对数值与保留时间（tR）的关系曲线。将等量多糖样品溶液在上述色谱条件下进样，根据其保留时间和关系曲线计算多糖分子质量。
1.2.5 NFP-2单糖组成比例
称取多糖样品5 mg，加入10 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，油浴110 ℃反应4 h。反应结束后，冷却至室温，加入2 mL甲醇减压蒸干，重复操作3次，以完全除去TFA。加入蒸馏水溶解样品，取100 μL样品溶液，置于1.5 mL的离心管中，然后参照文献[17]方法进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生。反应结束后，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，备高效液相色谱分析用。色谱条件如下：Inertsil ODS C-18柱（4.6 ×250 mm，5 μm）；流动相为1.0 mL/min乙腈/磷酸盐缓冲液（18:82，v/v）；检测波长245 nm；柱温35 ℃；进样量10.0 μL。分别配制单糖（氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖）标准溶液1 mg/mL，依照上述色谱方法分析，通过标准品的保留时间和峰面积，可以确定多糖样品中的单糖组成和计算摩尔百分比[17]。
1.2.6 红外光谱分析
称取干燥的多糖样品1~2 mg与200 mg溴化钾研磨，压制成透明的圆形薄片，在4000~400 cm−1范围内进行红外光谱扫描。
1.2.7 刚果红实验
取6份2 mg/mL的多糖溶液1.0 mL，分别加入3.0 mL不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mol/L）的NaOH溶液，然后再加入0.5 mL蒸馏水和1.5 mL 0.2 mmol/L刚果红溶液，涡旋混匀，静置1 h，设定200~800 nm扫描范围，记录各浓度NaOH溶液的最大吸收波长（λmax），空白对照组以蒸馏水替代多糖溶液[18]。
1.2.8 青天葵多糖的抗氧化活性
1.2.8.1 ABTS阳离子自由基清除率的测定
参照文献[19]方法测定。首先，将ABTS粉末溶于2.45 mmol/L过硫酸钾溶液中生成ABTS原液（7 mmol/L），然后在室温下于避光静置12 h后，用乙醇稀释至0.2 mmol/L。取96孔板，相应孔中加入180 μL ABTS溶液（0.2 mmol/L）与20 μL不同浓度的多糖溶液混合（0、0.2、0.5、1、2、4、8、10 mg/mL），混匀，室温下避光反应30 min。以维生素C为阳性对照，在734 nm处测定吸光度。
ABTS阳离子自由基清除率(%)=(1−A0−AsAc)×100 (3) 式中：A0为实验组吸光值；As用去离子水代替试剂做样品的本底比色吸光值；Ac为空白对照（以去离子水代替多糖溶液）。
1.2.8.2 羟基自由基清除率的测定
参照邵佳等[20]的方法测定。取96孔板，相应孔中分别加入50 μL的不同浓度的青天葵多糖溶液（0、1、2、4、6、8、10 mg/mL），然后依次加4 mmol/L硫酸亚铁溶液50 μL及4 mmol/L过氧化氢溶液50 μL，混匀，室温反应10 min，然后加入4 mmol/L水杨酸溶液50 μL，混匀，室温反应30 min，于510 nm处分别测定各孔吸光度，记录数据，实验重复3次，以抗坏血酸为阳性对照。计算多糖对羟基自由基的清除率，即公式为：
羟基自由基清除率(\%)=(1−A0−AsAc)×100 (2) 式中：A0为实验组吸光值；As用去离子水代替试剂做样品的本底比色吸光值；Ac为空白对照（以去离子水代替多糖溶液）。
1.2.8.3 DPPH自由基清除率的测定
参照文献[21]方法测定。取96孔板，相应孔中分别加入50 μL不同浓度的青天葵多糖溶液（0、0.5、1、2、4、8、10 mg/mL），再加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液，混匀，室温避光反应30 min，在517 nm下测定吸光度，测量3次。空白组以无水乙醇代替DPPH溶液。按下列公式计算DPPH自由基清除率，按公式（1）计算：
DPPH自由基清除率(\text \%)=(1−A0−AsAc)×100 (1) 式中：A0为实验组吸光值；As用去离子水代替试剂做样品的本底比色吸光值；Ac为空白对照（以去离子水代替多糖溶液）。
1.2.8.4 超氧阴离子自由基清除率的测定
采用邻苯三酚自氧化法[22]测定。取96孔板，相应孔中加入150 μL Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH8.2），再分别加入30 μL不同浓度的青天葵多糖（0、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL），混匀，室温避光反应10 min，然后加入30 μL的没食子酸溶液（6 mmol/L），混匀，室温避光反应3 min，最后加30 μL 8 mol/L盐酸终止反应。在325 nm处测定吸光度。空白组以用30 μL蒸馏水取代没食子酸溶液，其他步骤如上操作，测吸光度，计算样品对超氧阴离子自由基的清除率。
超氧阴离子自由基清除率(%)=(1−A0−AsAc)×100 (4) 式中：A0为实验组吸光值；As用去离子水代替试剂做样品的本底比色吸光值；Ac为空白对照（以去离子水代替多糖溶液）。
2. 结果与分析
2.1 青天葵多糖组分NFP-2的纯化
青天葵总多糖过DEAE-52纤维素层析柱，经蒸馏水、NaCl溶液梯度洗脱，洗脱曲线如图1所示，按照洗脱峰收集组分，共收集7个流份（DT-1~DT-7），分别减压浓缩、透析、冻干后进一步纯化。
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图 1 青天葵多糖DT-2的DEAE-52纤维素柱层析图Figure 1. Elution curve of DT-2 from DEAE-cellulose 52 anion exchange chromatogram将离子交换层析分离得到的DT-2溶于水进一步分离纯化，上样于Sephadex G-100凝胶柱，洗脱曲线如图2所示。收集峰尖部分，透析，浓缩，冻干后得到组分NFP-2进行下一步分析。
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图 2 青天葵多糖NFP-2的Sephadex G-100柱层析结果Figure 2. Elution curve of NFP-2 from Sephadex G-100 gel filtration chromatogram2.2 青天葵多糖NFP-2的基本理化特性
多糖NFP-2易溶于热水，不溶于乙醇、丙酮等有机试剂，经过测定其总糖含量为82.64%，糖醛酸含量为16.65%，蛋白质含量为6.38%。
2.3 青天葵多糖NFP-2的分子量及单糖组成
HPGPC测定结果如图3所示，色谱图出现一个单峰，确认NFP-2为单一组分，纯度为92.12%。根据多糖NFP-2的色谱保留时间带入标准多糖分子量回归曲线（lgMw=−0.3395Rt+8.4278，R2=0.9661），推算得到NFP-2的分子量为1150 kDa；经酸水解、高效液相色谱分析其单糖组成，结果如图4所示，主要由半乳糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸，其摩尔比为21.27:13.21:5.26:3.02:2.82:1，并含有少量的木糖、葡萄糖醛酸。
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图 4 基于PMP柱前衍生的青天葵多糖NFP-2（A）和标准品（B）的单糖液相色谱图注：1：D-甘露糖；2：D-氨基葡萄糖；3：D-鼠李糖；4：D-葡萄糖醛酸；5：D-氨基半乳糖；6：D-半乳糖醛酸；7：D-葡萄糖；8：D-半乳糖；9：D-木糖；10：L-阿拉伯糖；11：D-岩藻糖。Figure 4. HPLC chromatograms of the PMP derivatives of NFP-2 hydrolysate sample （A） and standard monosaccharide mixture （B）2.4 红外光谱分析
NFP-2的红外光谱图如图5所示，3401 cm−1处附近出现的强且宽的吸收峰归属于-OH的伸缩振动峰，是糖类的特征吸收峰，说明青天葵多糖NFP-2具有分子间氢键[23]。2931 cm−1处则发现甲基-CH3或次甲基-CH2的C-H的伸缩振动峰，是典型的多糖特征[24]，1400~1200 cm−1处出现C-H伸缩和变角振动峰，可初步判定为糖类化合物[25]。在1618 cm−1的-NH2和-NH3的特征吸收峰，说明存在蛋白多糖峰[26]，与蛋白质含量测定一致。1072 cm−1的吸收峰显示多糖糖环构型为吡喃型[27]。894 cm−1处的弱峰为吡喃环的β-端差向异构的C-H变角振动产生的[28]。由此推测多糖NFP-2为β-吡喃型多糖[29]。
2.5 刚果红实验结果分析
刚果红实验是研究多糖分子构象特性一种有效地方法。刚果红可以与具有螺旋构象的多糖分子发生络合反应，产生的络合物的最大吸收波长与纯刚果红相比会发生红移[30]。从图6可知，与纯刚果红溶液的λmax相比，刚果红-NFP-2多糖复合物的λmax发生红移。当添加不同浓度的NaOH溶液时，多糖的螺旋结构经过不同程度的展开，使复合物的λmax值减小，当NaOH浓度为0~0.4 mol/L时，复合物的λmax值发生变化。与纯刚果红溶液相比，NFP-2在各浓度的NaOH溶液中均无明显红移。因此，可以推断NFP-2在水溶液中缺乏三股螺旋构象。刚果红分析法只是确定多糖构象结构的初步方法，还需要其他方法来确定多糖的确切结构。
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图 6 青天葵多糖NFP-2与刚果红复合物在不同浓度NaOH溶液中的λmax变化Figure 6. Changes in the absorption maximum λmax of NFP-2 vatious concentrations of sodilum hydrolysis complexed with Congo red2.6 青天葵多糖NFP-2抗氧化活性分析
大量医学研究结果表明动脉粥样硬化、癌症、神经性疾病等多种疾病都与氧化胁迫有关。当机体内正常代谢产生的活性氧、活性氮超出人体自身抗氧化保护系统的范围就会对机体造成伤害。许多外源性物质如抗坏血酸、维生素E以及各种多酚物质可以抵抗活性氧造成的危害[31]。各种食品、天然动植物中富含这些物质，是保护人体健康的重要来源。因此抗氧化能力是评价食品、药品功效的一个重要指标。
目前使用的抗氧化测定方法非常多，以清除自由基测定抗氧化能力的方法是目前最流行、使用最多的方法。根据自由基的种类不同可以分为两大类：生物体中存在的自由基：超氧自由基、过氧化氢、羟自由基等；人工合成的自由基。目前最常用的自由基清除测定方法有ABTS法、羟自由基清除能力、DPPH法和超氧自由基清除能力法。研究表明多糖产生抗氧化性的机制之一是多糖可以直接与自由基发生反应，从而达到抗氧化作用[30]。为了研究多糖NFP-2的抗氧化能力，本文选择DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基测定NFP-2的清除自由基的能力。
从图7A~图7B中可知，NFP-2具有清除ABTS阳离子自由基、羟基自由基的活性，并且清除能力在0.1~10 mg/mL浓度范围内呈现剂量依赖效应，随着浓度增大而增强。在0.1~10 mg/mL内，NFP-2对ABTS阳离子自由基的清除率从9.43%增强到35.44%；对羟基自由基的清除率从10.09%增强到57.55%，其IC50为7.95 mg/mL。从图7C~图7D可知，NFP-2对DPPH自由基、超氧阴离子自由基的清除能力在设定浓度范围内无明显的剂量依赖效应。在质量浓度20~120 μg/mL内，NFP-2对DPPH自由基的清除能力较弱，始终维持在15%~17%；在质量浓度0.5~20 μg/mL内，NFP-2对超氧阴离子自由基的清除能力较强，始终维持在60%左右。
尽管多糖的自由基清除活性机制尚不完全明确，但相关研究表明，酸性多糖更易成为清除自由基的供氢剂，从而表现出更高的抗氧化活性[32]。由于NFP-2的糖醛酸含量较高，暴露的羧基参与了多糖与自由基的反应，从而使NFP-2对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力均达到50%以上。另外，在5~20 μg/mL浓度范围内，NFP-2的超氧阴离子自由基清除能力不存在浓度依赖性，表明NFP-2多糖的抗氧化活性并不是只受到单一因素影响，可能受到分子量、单糖组成、糖醛酸、取代基和链构象等多种因素的影响。
3. 结论
综上所述，从青天葵药材中分离纯化得到一个分子量为1150 kDa的水溶性多糖组分NFP-2。NFP-2主要由半乳糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸等单糖组成。结构分析表明多糖的糖苷键为β-吡喃型，无三股螺旋结构。抗氧化性评价表明NFP-2具有一定的自由基清除能力。这些结果将有助于青天葵多糖的进一步研究。
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图 1 青天葵多糖DT-2的DEAE-52纤维素柱层析图
Figure 1. Elution curve of DT-2 from DEAE-cellulose 52 anion exchange chromatogram
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图 2 青天葵多糖NFP-2的Sephadex G-100柱层析结果
Figure 2. Elution curve of NFP-2 from Sephadex G-100 gel filtration chromatogram
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图 4 基于PMP柱前衍生的青天葵多糖NFP-2（A）和标准品（B）的单糖液相色谱图
注：1：D-甘露糖；2：D-氨基葡萄糖；3：D-鼠李糖；4：D-葡萄糖醛酸；5：D-氨基半乳糖；6：D-半乳糖醛酸；7：D-葡萄糖；8：D-半乳糖；9：D-木糖；10：L-阿拉伯糖；11：D-岩藻糖。
Figure 4. HPLC chromatograms of the PMP derivatives of NFP-2 hydrolysate sample （A） and standard monosaccharide mixture （B）
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图 6 青天葵多糖NFP-2与刚果红复合物在不同浓度NaOH溶液中的λmax变化
Figure 6. Changes in the absorption maximum λmax of NFP-2 vatious concentrations of sodilum hydrolysis complexed with Congo red
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