Effect of Reaction Conditions on the Formation of 3-Deoxyglucosone and 5-Hydroxymethylfurfural in Sugar-acid Reaction System
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摘要: 为了分析糖-酸反应体系中3-脱氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）及5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）的形成规律，本研究构建了果糖/蔗糖/葡萄糖-柠檬酸反应体系，探究糖种类、pH、温度、金属离子种类和含不同价态硫的化合物对3-DG及5-HMF形成的影响，并分析了二者的形成动力学。结果表明：三种糖对3-DG和5-HMF形成的影响不同，果糖和蔗糖反应体系中3-DG和5-HMF生成量远高于葡萄糖反应体系，pH降低和温度升高可促进3-DG和5-HMF形成；Ca2+、Mg2+、Al3+均对3-DG和5-HMF的形成有促进作用；K+能促进3-DG的形成，但对5-HMF的形成无显著影响（P>0.05）。Na2S2O3和Na2SO3可以抑制3-DG及5-HMF的形成，而Na2S2O5对3-DG的形成无影响，但能抑制5-HMF的形成（P<0.05）；Na2SO4可促进3-DG及5-HMF的形成；70~90 ℃时3-DG的形成符合零级动力学模型，而100 ℃时符合二级动力学模型；70~100 ℃时5-HMF的形成符合零级动力学模型。
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关键词:
- 糖-酸反应体系 /
- 3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG) /
- 5-羟甲基糠醛(5-HMF) /
- 反应条件 /
- 动力学
Abstract: In this study, sugar-citric acid reaction systems were applied to study the formation of 3-deoxyglucosone(3-DG) and 5-hydroxymethylfurfural(5-HMF). Fructose/sucrose/glucose-citric acid reaction systems were constructed, the effects of sugar type, pH, temperature, types of metal ions and compounds with different valences of sulfur on the formation of 3-DG and 5-HMF were evaluated. The formation kinetics of 3-DG and 5-HMF were analyzed. Results indicated that the three types of sugar had different effects on the formation of 3-DG and 5-HMF. The amounts of 3-DG and 5-HMF produced in fructose and sucrose reaction systems were much higher than those in glucose reaction system. The amounts of 3-DG and 5-HMF in the fructose-citric acid reaction system increased with the decreasing of pH and the increasing of temperature. Ca2+, Mg2+ and Al3+ promoted the formation of 3-DG and 5-HMF. K+ accelerated the formation of 3-DG, but had no significant effect on the formation of 5-HMF(P>0.05). Na2S2O3 and Na2SO3 inhibited 3-DG and 5-HMF formation, while Na2S2O5 had no significant effect on 3-DG formation, but it inhibited the formation of 5-HMF(P<0.05). Na2SO4 promoted 3-DG and 5-HMF formation. The formation kinetics of 3-DG were in accordance with zero-order kinetics model at 70~90 oC while it followed second-order kinetics model at 100 oC. The formation of 5-HMF followed zero-order kinetics model at 70~100 oC. -
热加工可有效地破坏食品中的酶和微生物，降低水分活度，有利于食品保藏。但是，热加工也会促进内源性污染物的产生，如3-脱氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone, 3-DG）和5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural, 5-HMF）等[1-3]。研究发现，3-DG具有细胞毒性并会造成细胞损伤[4]，诱发糖尿病[5]；5-HMF会对人体的黏膜、皮肤和眼睛产生刺激作用[6-7]，并损伤肝、肾等器官[8-9]，对人体具有潜在危害。因此，研究食品中3-DG和5-HMF的生成规律迫在眉睫。
食品中的3-DG和5-HMF由己糖（果糖或葡萄糖）发生脱水反应形成。3-DG的形成途径有两条：a.在美拉德反应中，果糖或葡萄糖与氨基化合物反应形成Schiff碱，Schiff碱环化形成不稳定的Heyns和Amadori重排产物，pH≤7时通过烯醇化作用形成1,2-烯胺醇，该物质随后脱水形成3-DG[10-11]；b.在焦糖化反应中，己糖在酸性条件下也可通过烯醇化作用生成3-DG[10]。3-DG可进一步脱水形成3,4-二脱氧葡萄糖醛酮（3,4-dideoxyglucosone, 3,4-DG），3,4-DG脱去一分子水并环化形成5-HMF[8,10]，所以3-DG是5-HMF的前体物质之一。另外，在高温和干燥条件下，果糖和蔗糖可以形成高活性的呋喃果糖阳离子，该物质可直接转化为5-HMF[12]。
3-DG和5-HMF广泛存在于咖啡、曲奇、蜂蜜、果干等食品中[1,10]，但有关食品体系中3-DG和5-HMF形成规律的研究鲜有报道。因此，本实验以果糖、葡萄糖、蔗糖和柠檬酸为材料，构建糖-柠檬酸反应体系，研究糖种类、pH、温度、金属离子种类和含不同价态硫的化合物对3-DG及5-HMF形成的影响，并采用零级动力学、一级动力学和二级动力学模型拟合3-DG和5-HMF的形成过程，旨在为糖酸含量丰富的食品中3-DG和5-HMF的形成与控制提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
5-羟甲基糠醛（5-HMF，纯度≥98%，色谱纯） 上海源叶生物科技有限公司；3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG，纯度≥95%，色谱纯） 加拿大TRC公司；甲醇（色谱纯） 美国Spectrum公司；柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、果糖、蔗糖、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铝、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫酸钠、二乙三胺五乙酸（DETAPAC）、邻苯二胺 分析纯，北京普博欣生物科技责任有限公司。
Agilent 1200高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国安捷伦公司；Millipore型号超纯水系统 美国Millipore公司；HH-1数显恒温水浴锅 常州金坛良友仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 反应条件对糖-柠檬酸反应体系中3-DG及5-HMF形成的影响
1.2.1.1 糖种类的影响
用pH3的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液分别溶解果糖、蔗糖和葡萄糖，使其浓度为50 mmol/L，取2 mL于比色管中，在100 ℃下水浴反应1~9 h后，冰水浴中冷却至室温（约25 ℃），定容后测定3-DG及5-HMF含量。
1.2.1.2 pH的影响
分别用pH为3、4、5、6的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液溶解果糖，使其浓度为50 mmol/L，取2 mL于比色管中，在100 ℃下水浴反应1~9 h后，冰水浴中冷却至室温（约25 ℃），定容后测定3-DG及5-HMF含量。
1.2.1.3 温度的影响
用pH3的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液溶解果糖，使其浓度为50 mmol/L，取2 mL于比色管中，分别置于70、80、90、100 ℃下水浴反应1~9 h后，冰水浴中冷却至室温（约25 ℃），定容后测定3-DG及5-HMF含量。
1.2.1.4 金属离子的影响
用pH3的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液溶解果糖，并分别加入不同浓度的KCl、CaCl2、MgCl2或AlCl3，使果糖浓度为50 mmol/L，K+、Ca2+、Mg2+或Al3+的浓度为0、20、40、60、80、100 mmol/L。取2 mL混合液，置于100 ℃下水浴反应5 h后，冰水浴中冷却至室温（约25 ℃），定容后测定3-DG及5-HMF含量。
1.2.1.5 含不同价态硫的化合物的影响
用pH3的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液溶解果糖，并分别加入不同浓度的Na2S2O3、Na2SO3、Na2S2O5或Na2SO4（硫价态分别为+2、+4、+4、+6），使果糖浓度为50 mmol/L，各化合物的浓度分别为0、20、40、60、80、100 mmol/L。取2 mL混合液，置于100 ℃下水浴反应5 h后，冰水浴中冷却至室温（约25 ℃），定容后测定3-DG及5-HMF含量。
1.2.2 标准曲线的绘制
浓度为1000 mg/L的3-DG或5-HMF储备液的配制：分别称取3-DG、5-HMF标准品10 mg（精确至0.0001 g）于10 mL容量瓶，一级水溶解并定容，4 ℃冰箱保存。
3-DG标准曲线制作：配制浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、17.5和25.0 mg/L的3-DG标准工作液；取1 mL上述标准工作液，加入pH7、含18.5 mol/L DETAPAC、浓度为4 mg/mL的邻苯二胺溶液，在60 ℃下水浴反应1 h；反应结束后，样品经0.22 μm聚醚砜滤膜过滤，高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）待测。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制3-DG标准曲线。
5-HMF标准曲线制作：配制浓度分别为0.1、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的5-HMF标准工作溶液，经0.22 µm聚醚砜滤膜过滤，HPLC待测。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制5-HMF标准曲线。
1.2.3 3-DG的测定方法
3-DG的检测参考Hellwig等[13]的方法并稍作修改。3-DG的衍生方法如下：取反应液1 mL，加入pH7、含18.5 mol/L的DETAPAC、浓度为4 mg/mL的邻苯二胺溶液，60 ℃水浴1 h，用0.22 μm的聚醚砜滤膜过滤后，HPLC待测。3-DG的分析条件如下：色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm），柱温35 ℃；流动相为甲醇（A）和0.15%醋酸水溶液（B），流速为0.70 mL/min；洗脱条件为0~15 min，20%~50% A；15~18 min，50% A；18~20 min，50~20% A；20~28 min，20% A；检测波长为314 nm，进样量为20 μL。采用外标法定量，标准曲线为y=22.402x+1.4372，相关系数为0.9994。
1.2.4 5-HMF的测定方法
反应液用0.22 μm的聚醚砜滤膜过滤后，利用HPLC分析。5-HMF的分析条件如下：色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温35 ℃；流动相为甲醇（A）和水（B），流速为0.60 mL/min；洗脱条件为0~16 min，10% A；16~17 min，10%~45% A；17~23 min，45% A；23~24 min，45%~10% A；24~33 min，10% A；检测波长为284 nm，进样量为20 μL。采用外标法定量，标准曲线为y=208.27x+7.4183，相关系数为0.9999。
1.2.5 模型建立
采用零级动力学、一级动力学和二级动力学3种模型分析反应体系中3-DG和5-HMF的变化规律，其公式分别如下：
(1) (2) (3) 式中：t为反应时间，h；C0为3-DG和5-HMF的起始浓度，mg/L；Ct为3-DG和5-HMF在t时间的浓度，mg/L；k0、k1和k2分别为零级动力学、一级动力学和二级动力学的反应速率常数，mg·L−1·h−1、h−1和L·mg−1·h−1。
1.3 数据处理
实验结果以平均值±标准偏差表示；采用SAS 9.2软件对实验数据进行统计分析，显著性检验水平为P=0.05；采用Origin8.0软件绘制图形；采用SPSS 19.0软件进行动力学分析。
2. 结果分析
2.1 糖的种类对糖-柠檬酸反应体系中3-DG及5-HMF形成的影响
在pH3、糖液浓度为50 mmol/L、温度100 ℃条件下，研究糖的种类（果糖、蔗糖和葡萄糖）对3-DG和5-HMF形成的影响，结果如图1所示。从图1A可知，随加热时间延长，3种糖-柠檬酸反应体系中3-DG的生成量均逐渐增加，且果糖和蔗糖反应体系3-DG生成量远高于葡萄糖反应体系；反应结束时（9 h），果糖和蔗糖反应体系中3-DG生成量分别为葡萄糖反应体系的32.8和31.2倍。在果糖和蔗糖反应体系中，3-DG的形成过程可分为两个阶段。a.快速形成阶段（0~5 h）：两反应体系中3-DG生成量分别高达106.9和111.8 mg/L；b.缓慢形成阶段（5~9 h）：两反应体系3-DG的量继续逐渐增加，但增长趋势变慢，仅分别增加了20.8和9.6 mg/L；反应9 h时，两反应体系3-DG生成量分别达到127.7和121.4 mg/L的最大值。在酸性条件下加热，蔗糖易发生水解形成葡萄糖和果糖。葡萄糖的结构在溶液中较果糖稳定，这导致单独的葡萄糖体系形成3-DG的量较蔗糖和果糖体系少[14]。
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图 1 糖种类对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响Figure 1. Effects of sugar types on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）5-HMF的形成如图1B所示，随加热时间延长，果糖、蔗糖和葡萄糖反应体系中5-HMF含量均逐渐增加，反应9 h时，果糖和蔗糖反应体系中5-HMF生成量分别达到159.9和149.6 mg/L的最大值，为葡萄糖反应体系的30.8和28.8倍，该结果与张玉玉等[14]的研究一致。这是因为在酸性加热条件下，蔗糖易发生水解形成葡萄糖和果糖，而水解产生的果糖是蔗糖反应体系中形成5-HMF的主要反应物，且果糖转化成5-HMF的速率比葡萄糖快；另一方面，葡萄糖在水中以环状的结构稳定存在，不易发生烯醇化反应，难以转化为5-HMF[15]。因此，本实验中果糖和蔗糖反应体系5-HMF形成趋势相似，且形成量远多于葡萄糖。
采用零级动力学、一级动力学和二级动力学模型对3种反应体系中3-DG和5-HMF生成过程进行拟合，结果如表1和表2所示。从表1可以看出，R2二级动力学>R2零级动力学>R2一级动力学，且二级动力学模型的R2均大于0.95，说明本研究条件下，3-DG的形成更符合二级动力学模型，即其生成量与加热时间成对数关系。从表2可以看出，采用零级动力学模型分析5-HMF的形成时，各决定系数R2均大于0.95，说明其生成量与加热时间成线性关系。以上动力学结果表明，二级动力学和零级动力学可以分别预测3种反应体系中3-DG和5-HMF的形成。此外，蔗糖和果糖反应体系中3-DG和5-HMF的反应速率常数k均明显大于葡萄糖反应体系，说明这两种反应体系中3-DG和5-HMF的形成速率比葡萄糖反应体系的更快。蔗糖和果糖反应体系中，3-DG的反应速率常数非常接近，5-HMF的速率常数也呈现相似规律，说明两个体系3-DG和5-HMF的形成速率均较为接近，与图1中两反应体系3-DG（A）和5-HMF（B）生成曲线一致的结果吻合。
表 1 不同糖-柠檬酸反应体系中3-DG的形成动力学分析Table 1. Kinetics analysis of 3-DG formation in different sugar-citric acid reaction systems糖种类 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 蔗糖（1~9 h） Ct=36.03+12.13t 12.13 0.8282 Ct=37.58exp（0.17t） 0.17 0.6982 Ct=25.61+49.95lnt 49.95 0.9691 果糖（1~9 h） Ct=41.65+11.30t 11.30 0.8868 Ct=45.44exp（0.14t） 0.14 0.7793 Ct=33.67+45.34lnt 45.34 0.9846 葡萄糖（1~9 h） Ct=0.56+0.47t 0.47 0.8141 Ct=0.16exp（0.47t） 0.47 0.4402 Ct=0.16+1.92lnt 1.92 0.9529 表 2 不同糖-酸柠檬酸反应体系中5-HMF的形成动力学分析Table 2. Kinetics analysis of 5-HMF formation in different sugar-citric acid systems糖种类 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 蔗糖（1~9 h） Ct=−24.61+19.31t 19.31 0.9899 Ct=5.54exp（0.42t） 0.42 0.8593 Ct=−25.34+68.38lnt 68.38 0.8565 果糖（1~9 h） Ct=−23.01+20.11t 20.11 0.9900 Ct=8.03exp（0.38t） 0.38 0.8880 Ct=−23.76+71.22lnt 71.22 0.8563 葡萄糖（1~9 h） Ct=−1.19+0.72t 0.72 0.9839 Ct=0.04exp（0.63t） 0.63 0.7485 Ct=−1.17+2.51lnt 2.51 0.8304 2.2 pH对果糖-柠檬酸反应体系中3-DG及5-HMF形成的影响
在果糖浓度为50 mmol/L，温度100 ℃条件下，研究pH（3~6）对3-DG和5-HMF形成的影响，结果如图2所示。方差分析表明，pH对3-DG的形成具有显著影响（P<0.05），且反应体系pH越小，3-DG生成量越大；反应结束时（9 h），pH3的反应体系中3-DG生成量高达127.7 mg/L，分别是pH为4、5、6的1.2、1.6和4.1倍。其原因可能是：反应体系pH的降低促进了果糖发生烯醇化反应生成3-DG[10]。另外，pH4~6的反应体系中，反应后期（8~9 h）3-DG含量略有下降，这与3-DG化学性质活泼可能进一步降解形成丙酮醛、5-HMF等产物有关[2]。
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图 2 pH对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响Figure 2. Effects of pH on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）pH对5-HMF形成的影响如图2B所示，pH的降低能显著促进5-HMF形成（P<0.05），反应9 h时，在pH3的反应体系中，5-HMF生成量分别是pH为4、5、6反应体系的1.3、5.7和69.4倍；这可能与低pH下3-DG（5-HMF的前体物）生成量增大有关。Pham等的研究发现，降低橙汁pH能促进5-HMF的形成[16]，陈醋中5-HMF含量与有机酸含量之间也存在正相关关系[17]，这与本实验的规律一致。因此，在实际生产过程中可适当提高反应体系pH以抑制3-DG和5-HMF的形成。
为探究不同pH下3-DG和5-HMF的生成规律，分别采用零级动力学、一级动力学和二级动力学模型对3-DG和5-HMF的生成过程进行拟合（pH为4、5、6的反应体系中，3-DG生成量在后期呈现下降趋势，故分别选取三者中1~8、1~6和1~3 h的时间段进行3-DG形成动力学分析），结果如表3所示。从表3可以看出，R2二级动力学>R2零级动力学>R2一级动力学，且二级动力学模型的R2均大于0.92，说明3-DG的形成符合二级动力学模型，即其生成量与加热时间成对数关系。5-HMF的动力学分析结果如表4所示，通过比较这3个动力学模型的R2，发现5-HMF的形成符合零级动力学模型（R2>0.90），其形成量与时间成线性关系。以上动力学结果表明，二级动力学和零级动力学可以分别较好地预测pH3~6的反应体系中3-DG和5-HMF的形成。通过比较3-DG和5-HMF最适动力学模型的k值发现，k值均随pH的降低而增大，说明pH越小，3-DG和5-HMF生成速率越高。
表 3 不同pH下3-DG的形成动力学分析Table 3. Kinetics analysis of 3-DG formation under different pH valuespH 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 pH3（1~9 h） Ct=41.65+11.30t 11.30 0.8868 Ct=45.44exp（0.14t） 0.14 0.7793 Ct=33.67+45.34lnt 45.34 0.9846 pH4（1~8 h） Ct=56.09+8.94t 8.94 0.7246 Ct=55.21exp（0.11t） 0.11 0.6456 Ct=49.62+35.22lnt 35.22 0.9278 pH5（1~6 h） Ct=42.45+9.59t 9.59 0.7917 Ct=43.43exp（0.15t） 0.15 0.7134 Ct=43.47+29.68lnt 29.68 0.9513 pH6（1~3 h） Ct=32.81+4.13t 4.13 0.8708 Ct=33.27exp（0.10t） 0.10 0.8615 Ct=36.42+7.78lnt 7.78 0.9534 表 4 不同pH下5-HMF的形成动力学分析Table 4. Kinetics analysis of 5-HMF formation under different pH valuespH 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 pH3（1~9 h） Ct=−23.01+20.11t 20.11 0.9900 Ct=8.03exp（0.38t） 0.38 0.8880 Ct=−23.76+71.22lnt 71.22 0.8563 pH4（1~9 h） Ct=−23.36+15.32t 15.32 0.9827 Ct=3.04exp（0.47t） 0.47 0.8716 Ct=−22.80+53.46lnt 53.46 0.8252 pH5（1~9 h） Ct=−5.59+3.53t 3.53 0.9778 Ct=0.37exp（0.56t） 0.56 0.7750 Ct=−5.46+12.30lnt 12.30 0.8207 pH6（1~9 h） Ct=−0.46+0.23t 0.23 0.9567 Ct=0.0046exp（0.76t） 0.76 0.8190 Ct=−0.43+0.78lnt 0.78 0.7777 2.3 温度对果糖-柠檬酸反应体系中3-DG及5-HMF形成的影响
本实验研究了pH3、果糖浓度为50 mmol/L条件下，温度（70、80、90、100 ℃）对果糖-柠檬酸反应体系中3-DG和5-HMF形成的影响，结果如图3所示。方差分析结果表明，温度显著影响反应体系3-DG及5-HMF的形成（P<0.05），且温度越高，3-DG及5-HMF生成量越大。温度70~90 ℃时，温度每升高10 ℃，相同反应时间下3-DG生成量约增加了1.9~3.3倍，但温度从90 ℃提升至100 ℃时，其生成量增加了10.4~19.5倍。温度对5-HMF形成的影响表现出类似的规律（图3B），反应9 h时，100 ℃条件下5-HMF的生成量分别为90、80、70 ℃的5.4、23.5和181.9倍。温度提高对3-DG和5-HMF形成的促进作用体现在两方面：一是温度的提升可促进果糖的开环，而开环的果糖具有较高的反应活性[18]；二是较高的温度可促进烯醇化作用和脱水反应，有利于果糖经烯醇化作用形成3-DG，后者进一步脱水形成5-HMF[8,19]。此外，果糖的熔点为95 ℃，当温度提高至100 ℃时，果糖已处于熔融状态，该状态下的果糖极易发生焦糖化反应，导致3-DG和5-HMF大量形成[20]。
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图 3 温度对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响Figure 3. Effects of temperature on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）分别采用零级动力学、一级动力学和二级动力学模型对不同温度下3-DG和5-HMF的形成过程进行拟合，结果如表5和表6所示。从表5可知，温度100 ℃条件下，R2二级动力学>R2零级动力学>R2一级动力学，与零级动力学和一级动力学模型相比，采用二级动力学模型拟合3-DG的形成过程时，所得方程的R2更高，说明该模型可以很好地描述100 ℃时3-DG的形成；温度为70、80和90 ℃时，零级动力学模型的R2最高，说明上述温度条件下，3-DG的形成符合零级动力学模型。5-HMF的动力学结果如表6所示（在70 ℃条件下，反应1~5 h内无5-HMF形成，故该温度下仅采用6~9 h的数据对5-HMF形成动力学进行分析），温度在70~100 ℃时，零级动力学模型的R2更高，说明5-HMF的形成与时间成线性关系。上述动力学结果表明，在70~90和100 ℃条件下，3-DG的形成分别符合零级和二级动力学模型；零级动力学模型可用于预测70~100 ℃下5-HMF的形成。
表 5 不同温度下3-DG的形成动力学分析Table 5. Kinetics analysis of 3-DG formation at different temperatures温度 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 100 ℃（1~9 h） Ct=41.65+11.30t 11.30 0.8868 Ct=45.44exp（0.14t） 0.14 0.7793 Ct=33.67+45.34lnt 45.34 0.9846 90 ℃（1~9 h） Ct=1.07+1.28t 1.28 0.9735 Ct=2.26exp（0.21t） 0.21 0.8740 Ct=0.69+4.75lnt 4.75 0.9304 80 ℃（1~9 h） Ct=0.24+0.65t 0.65 0.9926 Ct=0.90exp（0.24t） 0.24 0.8821 Ct=0.06+2.41lnt 2.41 0.9394 70 ℃（1~9 h） Ct=0.13+0.18t 0.23 0.9919 Ct=0.30exp（0.23t） 0.23 0.9409 Ct=-0.0040+0.82lnt 0.82 0.8752 表 6 不同温度下5-HMF的形成动力学分析Table 6. Kinetics analysis of 5-HMF formation at different temperatures温度 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 100 ℃（1~9 h） Ct=−23.01+20.11t 20.11 0.9900 Ct=8.03exp（0.38t） 0.38 0.8880 Ct=−23.76+71.22lnt 71.22 0.8563 90 ℃（1~9 h） Ct=−4.80+3.48t 3.48 0.9479 Ct=1.03exp（0.41t） 0.41 0.8681 Ct=−4.62+12.12lnt 12.12 0.7914 80 ℃（1~9 h） Ct=−1.41+0.88t 0.88 0.9800 Ct=0.06exp（0.62t） 0.62 0.7062 Ct=−1.38+3.06lnt 3.06 0.8220 70 ℃（6~9 h） Ct=−0.81+0.19t 0.19 0.9960 Ct=0.05exp（0.33t） 0.33 0.9953 Ct=−2.15+1.37lnt 1.37 0.9811 2.4 金属离子种类对果糖-柠檬酸反应体系中3-DG及5-HMF形成的影响
本研究在pH3、果糖浓度为50 mmol/L、温度100 ℃、加热5 h的条件下，分析金属离子种类（K+、Ca2+、Mg2+及Al3+，0~100 mmol/L）对果糖-柠檬酸反应体系3-DG及5-HMF形成的影响，结果如图4所示。从图4A可知，K+、Ca2+、Mg2+和Al3+离子的添加能显著促进3-DG的形成（P<0.05），当其浓度分别为40、100、80、80 mmol/L时，对3-DG形成的促进作用最大，与对照相比，分别增加了12.2%、74.9%、26.6%和48.8%。然而，在一定浓度下，K+（20、60、80 mmol/L）、Mg2+（20 mmol/L）和Al3+（20 mmol/L）的添加对3-DG的形成与对照相比无显著影响（P>0.05）。上述结果表明，金属离子对果糖-柠檬酸反应体系中3-DG形成的影响与其种类和浓度均有关。
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图 4 金属离子对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响Figure 4. Effects of metal ions on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）离子种类对5-HMF形成的影响如图4B所示。Ca2+、Mg2+和Al3+的添加可显著促进5-HMF的形成（P<0.05），并且三者的促进作用随其浓度的升高而增强，当其浓度为100 mmol/L时，5-HMF的生成量最大，分别高达165.2、129.9和539.2 mg/L，与对照相比，分别增加了125.5%、77.5%和623.3%。该结果与Mesías等[21]的研究结果一致。其原因可能为，Ca2+、Mg2+可催化己糖水解，形成具有高反应活性的呋喃果糖阳离子，该物质进一步转化为5-HMF[22]。Al3+能同时促进3-DG（图4A）和5-HMF的形成，但是其对5-HMF的促进作用远大于3-DG，可能是因为Al3+催化果糖形成呋喃果糖阳离子的作用强于形成3-DG，前者则比3-DG更能有效转化成5-HMF[23]。此外，从图4B可知，K+对5-HMF的形成无显著影响（P>0.05）。Wen等[24]发现K+可促进葡萄糖-天冬酰胺反应体系中5-HMF的形成，这与本实验结果不同，可能与反应体系和反应条件有关。
2.5 含不同价态硫的化合物对果糖-柠檬酸反应体系3-DG及5-HMF形成的影响
本研究在pH3、果糖浓度为50 mmol/L、温度100 ℃、加热5 h的条件下，分析了含不同价态硫的化合物（Na2S2O3、Na2SO3、Na2S2O5、Na2SO4，+2、+4、+4、+6，0~100 mmol/L）对果糖-柠檬酸反应体系中3-DG和5-HMF形成的影响，结果如图5所示。从图5A可以看出：当Na2S2O3浓度为40 mmol/L时，其对3-DG的形成有明显抑制作用，抑制率为7.1%，但其他浓度下对3-DG的形成无显著影响（P>0.05），这表明Na2S2O3对3-DG的作用效果与其浓度有关；随Na2SO3浓度增大，其对3-DG形成的抑制效果增强，当其浓度为100 mmol/L时，3-DG生成量与对照相比减少了30.4%，亚硫酸根可与糖类物质的醛基形成加合物[20]，在本研究中，推测亚硫酸根可能通过与果糖发生缩合反应，从而抑制3-DG的形成；Na2S2O5对3-DG的形成无显著作用效果（P>0.05）；Na2SO4则可显著促进3-DG的形成（P<0.05），且随Na2SO4浓度从20 mmol/L提高至80 mmol/L，3-DG生成量增加了18.7%。上述结果表明，含不同价态硫的化合物对3-DG形成的影响不同，含低价态硫的化合物（+2、+4价）对3-DG的形成无显著影响（P>0.05）或可抑制其形成，而含高价态（+6价）硫的化合物对其形成具有促进作用。
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图 5 含不同价态硫的化合物对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响Figure 5. Effects of compounds with different valences of sulfur on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）含不同价态硫的化合物对5-HMF形成的作用效果与3-DG不同（图5B）。首先，随Na2SO4浓度增大，其对5-HMF形成的促进作用增强，当其浓度为100 mmol/L时，与对照相比，5-HMF生成量增加了70.6%，该结果与Sun等[25]的研究一致，其原因为Na2SO4可催化果糖转化成5-HMF的反应，促进5-HMF的形成。其次，Na2S2O3、Na2S2O5和Na2SO3则显著抑制5-HMF的形成（P<0.05）；Na2S2O3浓度从40 mmol/L增加至100 mmol/L时，5-HMF生成量降低，5-HMF抑制率从11.2%提升至26.3%；Na2S2O5和Na2SO3对5-HMF的抑制有相似的规律，当浓度为40 mmol/L时，二者对5-HMF抑制率分别为99.1%和96.2%，但随浓度（60~100 mmol/L）进一步增大，与40 mmol/L相比，二者对5-HMF的抑制效果已无显著提升（P>0.05），这与Li等[26]的结果一致。Na2SO3的添加可同时抑制3-DG（图5A）和5-HMF的形成，这表明Na2SO3引起5-HMF含量的减少与其抑制了5-HMF的前体物3-DG形成有关。此外，亚硫酸根可与5-HMF的羰基发生反应，从而减少已生成5-HMF的量[27]。综上所述，含低价态硫的化合物（+2、+4价）能抑制5-HMF的形成，而含高价态（+6价）硫的化合物对其形成具有促进作用。
3. 结论
本研究分析了糖种类、pH、温度、离子种类和含不同价态硫的化合物对糖-柠檬酸体系中3-DG和5-HMF形成的影响及二者的形成动力学。得出如下结论：
a.果糖和蔗糖较葡萄糖更容易转化成3-DG及5-HMF，果糖/蔗糖-柠檬酸反应体系中3-DG生成量分别高达127.7和121.4 mg/L，5-HMF的生成量分别高达159.9和149.6 mg/L。3-DG及5-HMF生成量随pH（3~6）的提高而降低。温度升高（70~100 ℃）可促进3-DG和5-HMF的生成。在70~90 ℃下，3-DG的形成符合零级动力学模型；100 ℃下，其形成符合二级动力学模型。在100 ℃条件下，5-HMF的形成符合零级动力学。
b.金属离子种类和含不同价态硫的化合物对果糖-柠檬酸反应体系3-DG及5-HMF的形成有显著影响（P<0.05）。Ca2+、Mg2+、Al3+均能促进体系中3-DG和5-HMF的形成，且金属离子浓度越高，二者生成量越大；K+仅能促进体系中3-DG的形成。硫价态为+2的Na2S2O3可抑制3-DG与5-HMF的形成，且对3-DG的抑制作用与其浓度有关；硫的价态为+4的化合物中，Na2SO3可同时抑制3-DG和5-HMF的形成，Na2S2O5对3-DG形成无显著影响（P˃0.05），但可抑制5-HMF的形成；硫价态为+6的Na2SO4对3-DG和5-HMF的形成起促进作用。本研究可为食品中3-DG和5-HMF的形成与控制提供理论参考。
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图 1 糖种类对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响
Figure 1. Effects of sugar types on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）
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图 2 pH对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响
Figure 2. Effects of pH on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）
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图 3 温度对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响
Figure 3. Effects of temperature on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）
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图 4 金属离子对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响
Figure 4. Effects of metal ions on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）
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图 5 含不同价态硫的化合物对3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影响
Figure 5. Effects of compounds with different valences of sulfur on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）
表 1 不同糖-柠檬酸反应体系中3-DG的形成动力学分析
Table 1 Kinetics analysis of 3-DG formation in different sugar-citric acid reaction systems
糖种类 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 蔗糖（1~9 h） Ct=36.03+12.13t 12.13 0.8282 Ct=37.58exp（0.17t） 0.17 0.6982 Ct=25.61+49.95lnt 49.95 0.9691 果糖（1~9 h） Ct=41.65+11.30t 11.30 0.8868 Ct=45.44exp（0.14t） 0.14 0.7793 Ct=33.67+45.34lnt 45.34 0.9846 葡萄糖（1~9 h） Ct=0.56+0.47t 0.47 0.8141 Ct=0.16exp（0.47t） 0.47 0.4402 Ct=0.16+1.92lnt 1.92 0.9529 
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表 2 不同糖-酸柠檬酸反应体系中5-HMF的形成动力学分析
Table 2 Kinetics analysis of 5-HMF formation in different sugar-citric acid systems
糖种类 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 蔗糖（1~9 h） Ct=−24.61+19.31t 19.31 0.9899 Ct=5.54exp（0.42t） 0.42 0.8593 Ct=−25.34+68.38lnt 68.38 0.8565 果糖（1~9 h） Ct=−23.01+20.11t 20.11 0.9900 Ct=8.03exp（0.38t） 0.38 0.8880 Ct=−23.76+71.22lnt 71.22 0.8563 葡萄糖（1~9 h） Ct=−1.19+0.72t 0.72 0.9839 Ct=0.04exp（0.63t） 0.63 0.7485 Ct=−1.17+2.51lnt 2.51 0.8304
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表 3 不同pH下3-DG的形成动力学分析
Table 3 Kinetics analysis of 3-DG formation under different pH values
pH 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 pH3（1~9 h） Ct=41.65+11.30t 11.30 0.8868 Ct=45.44exp（0.14t） 0.14 0.7793 Ct=33.67+45.34lnt 45.34 0.9846 pH4（1~8 h） Ct=56.09+8.94t 8.94 0.7246 Ct=55.21exp（0.11t） 0.11 0.6456 Ct=49.62+35.22lnt 35.22 0.9278 pH5（1~6 h） Ct=42.45+9.59t 9.59 0.7917 Ct=43.43exp（0.15t） 0.15 0.7134 Ct=43.47+29.68lnt 29.68 0.9513 pH6（1~3 h） Ct=32.81+4.13t 4.13 0.8708 Ct=33.27exp（0.10t） 0.10 0.8615 Ct=36.42+7.78lnt 7.78 0.9534
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表 4 不同pH下5-HMF的形成动力学分析
Table 4 Kinetics analysis of 5-HMF formation under different pH values
pH 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 pH3（1~9 h） Ct=−23.01+20.11t 20.11 0.9900 Ct=8.03exp（0.38t） 0.38 0.8880 Ct=−23.76+71.22lnt 71.22 0.8563 pH4（1~9 h） Ct=−23.36+15.32t 15.32 0.9827 Ct=3.04exp（0.47t） 0.47 0.8716 Ct=−22.80+53.46lnt 53.46 0.8252 pH5（1~9 h） Ct=−5.59+3.53t 3.53 0.9778 Ct=0.37exp（0.56t） 0.56 0.7750 Ct=−5.46+12.30lnt 12.30 0.8207 pH6（1~9 h） Ct=−0.46+0.23t 0.23 0.9567 Ct=0.0046exp（0.76t） 0.76 0.8190 Ct=−0.43+0.78lnt 0.78 0.7777
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表 5 不同温度下3-DG的形成动力学分析
Table 5 Kinetics analysis of 3-DG formation at different temperatures
温度 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 100 ℃（1~9 h） Ct=41.65+11.30t 11.30 0.8868 Ct=45.44exp（0.14t） 0.14 0.7793 Ct=33.67+45.34lnt 45.34 0.9846 90 ℃（1~9 h） Ct=1.07+1.28t 1.28 0.9735 Ct=2.26exp（0.21t） 0.21 0.8740 Ct=0.69+4.75lnt 4.75 0.9304 80 ℃（1~9 h） Ct=0.24+0.65t 0.65 0.9926 Ct=0.90exp（0.24t） 0.24 0.8821 Ct=0.06+2.41lnt 2.41 0.9394 70 ℃（1~9 h） Ct=0.13+0.18t 0.23 0.9919 Ct=0.30exp（0.23t） 0.23 0.9409 Ct=-0.0040+0.82lnt 0.82 0.8752
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表 6 不同温度下5-HMF的形成动力学分析
Table 6 Kinetics analysis of 5-HMF formation at different temperatures
温度 零级动力学 一级动力学 二级动力学 公式 k R2 公式 k R2 公式 k R2 100 ℃（1~9 h） Ct=−23.01+20.11t 20.11 0.9900 Ct=8.03exp（0.38t） 0.38 0.8880 Ct=−23.76+71.22lnt 71.22 0.8563 90 ℃（1~9 h） Ct=−4.80+3.48t 3.48 0.9479 Ct=1.03exp（0.41t） 0.41 0.8681 Ct=−4.62+12.12lnt 12.12 0.7914 80 ℃（1~9 h） Ct=−1.41+0.88t 0.88 0.9800 Ct=0.06exp（0.62t） 0.62 0.7062 Ct=−1.38+3.06lnt 3.06 0.8220 70 ℃（6~9 h） Ct=−0.81+0.19t 0.19 0.9960 Ct=0.05exp（0.33t） 0.33 0.9953 Ct=−2.15+1.37lnt 1.37 0.9811
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