Optimization of Extraction Process of Buddleoside in Chrysanthemum indicum L. by Response Surface Methodology and Determination of Buddleoside Content in C. indicum L. from Different Regions in Dawu County
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摘要: 为了探究湖北省大悟县不同地区分布的野菊花中蒙花苷的含量，本研究在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken法设计了4因素3水平的响应面试验，对影响蒙花苷得率的主要因素进行了优化，并以最优工艺测定了湖北省孝感市大悟县不同区域野菊花样品中的蒙花苷含量。工艺优化结果表明，溶质质量分数、液料比、提取温度、提取时间是影响蒙花苷得率的四个主要因素。其中，提取温度对蒙花苷得率的影响最大，随后依次是提取时间、液料比和溶质质量分数。蒙花苷最优提取工艺为：乙醇质量分数54%、液料比150:1 (mL/g)、提取温度80 ℃、提取时间60 min，蒙花苷对应得率为2.75%±0.03%，与模型预测值2.80%无显著性差异。且该工艺条件还展现出稳定性好（RSD<5%）、精密度高（RSD<5%）、加标回收率优良（>80%）等特点，适用于实际野菊花样本中蒙花苷含量的测定。含量结果表明，大悟县不同地区野菊花样品中蒙花苷含量差异较大，介于0~2.75%之间，其中第027、037、060、094号取样地蒙花苷含量较高，均超过2.5%。本研究可为野菊花食材或药材的质量评价提供可靠方法，也可为高蒙花苷含量野菊花优良品种的种植和选育提供重要依据。Abstract: In order to explore the content of buddleoside in the Chrysanthemum indicum L. of Dawu County, Hubei Province, based on single factor experimental analysis, the Box-Behnken design was used to optimize the main factors affecting the yield of buddleoside in this study. And the content of buddleoside in C. indicum L. samples from different regions in Dawu County, Xiaogan City, Hubei Province was determined by using the optimum extraction process. The results showed that the solute mass fraction, liquid-solid ratio, extraction temperature and extraction time were the four main factors affecting the yield of buddleoside, and the extraction temperature had the most influence on the yield of buddleoside, followed by the extraction time, liquid-solid ratio and solute mass fraction. The optimum extraction conditions were as follows: mass fraction of ethanol was 54%, liquid-solid ratio was 150:1 (mL/g), extraction temperature was 80 ℃ and extraction time was 60 min. Under optimum conditions, the yield of buddleoside was 2.75%±0.03%, which was not significantly different from the predicted value of 2.80%. In addition, the conditions of the extraction process showed good stability (RSD<5%), high precision (RSD<5%), good recoveries (more than 80%), which was suitable for the determination of the content of buddleoside in the samples of C. indicum L.. The results showed that there were great differences in the content of buddleoside in C. indicum L. samples from different regions in Dawu County, ranging from 0 to 2.75%. Among them, samples 027, 037, 060 and 094 had higher content of buddleoside, all of which exceeded 2.5%. Our study can provide a reliable method for the quality evaluation of food materials and medicinal materials of C. indicum L., and could also provide an important basis for the cultivation and breeding of fine varieties of C. indicum L. with high content of buddleoside.
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野菊花（Chrysanthemum indicum L.）又名苦薏，味苦、辛，性凉,具有广谱抗菌、抗病毒、降压、疏散风热、解毒护肝的药用效力[1-3]。野菊花喜凉爽湿润气候，耐寒，在我国分布较为广泛。孝感市大悟县地处东北部鄂豫边界，大别山西南段[4]，为典型的亚热带季风气候，四季分明、雨水充沛，适宜野菊花的生长，野菊花也因此成为了当地著名的特色资源。“十四五”时期以来，乡村振兴战略全面进入发力期，大力发展农村经济、建设高水平的农村全面小康、全面提高脱贫质量已刻不容缓[5]。孝感市大悟县作为革命老区和拥有诸多全国著名红色旅游景点[6]，地处偏僻山区[7]，旅游业难以发展，亟待寻求其他方式以促进当地经济高速、高质量发展。野菊花作为一种药食两用的植物，自古以来即得到广泛应用。在食品材料方面，由于其颜色鲜艳、气味物质复杂，气味独特芬芳[8]，因而常被作为茶饮、食品色素添加剂以及风味调节剂等。黄芳等[9]在野菊花黄色素的相关研究中发现，野菊花黄色素作为食品添加剂不仅具有较好的稳定性，还具有较好的抗氧化能力，是一种优良的植物色素。
据报道，野菊花含有的主要活性成分包括黄酮类物质、挥发油类以及多种微量元素[10]。蒙花苷就是野菊花中一种重要的黄酮类化合物，具有显著的抗菌消炎[11-14]、抗衰老[15]、抗肿瘤[16]、降糖降压[17-18]功效。研究表明，酶预处理技术[19-22]与微波辅助等[23]技术能够有效提取植物中活性组分，提升了目标产物得率。例如，孙平等在微波辅助新型溶剂提取野菊花总黄酮的研究中，采用响应面法对溶剂含水量、料液比、温度、提取时间、超声功率进行优化，确定出最佳条件为溶剂含水量28%、料液比1:25（g:mL）、微波功率450 W、提取时间38 min的微波提取法，对野菊花总黄酮的提取率达到了62.16 mg/g[24]；张明等采用正交试验设计的方法，优化了野菊花中蒙花苷回流提取过程，确定出80%乙醇、液料比1:8、提取3次，每次提取2 h的最优回流提取方案[25]。目前，相关研究主要集中于对野菊花蒙花苷含量测定方法的建立[26-27]或是采用正交试验的方式优化提取工艺参数，且提取次数较多，时间较长[2,28]，尚且缺乏对于最优工艺能否用于测定蒙花苷绝对含量的可行性验证，和用于真实样本中蒙花苷定量的系统研究。
本试验以常规的溶剂回流提取法为基础，采用Box-Behnken响应面试验，以蒙花苷的得率作为评价指标，对能够影响蒙花苷得率的主要因素（溶剂种类、溶质质量百分数、提取时间、提取温度、液料比）进行优化，以获得最优的工艺参数，为蒙花苷提取工艺的制定提供理论依据。同时，以最优的工艺条件，对孝感市大悟县各地区采集的野菊花样品进行蒙花苷含量测定，以期在优化提取工艺的同时，找到最有利于野菊花合成蒙花苷的种植区域，为大悟县种植富含蒙花苷的野菊花提供指导，为该地蒙花苷提取分离的产业化提供理论支撑。
1. 材料和方法
1.1 材料与仪器
野菊花样品 于2020年11月1~5日（野菊花盛花期），采自孝感市大悟县全县内不同区域，共计121份样品；色谱级甲醇 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇 中天化工有限责任公司；蒙花苷标准品 上海源叶生物科技有限公司。
DZKW-S-6型恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；HITACHI高效液相色谱仪 日本日立公司；超纯水仪 成都渗源科技有限公司；离心机 北京时代北利离心机有限公司；超声仪 上海之信仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 野菊花采样及样本的预处理
孝感市大悟县野菊花样本采样工作，按4 km×4 km方格网布置采样区，全县共设121个采样区（图1），覆盖全县17个乡镇。野菊花样本按规范采集，同时借助手机奥维地图选点定点定位各采样点。筛选品质好的野菊花，冲洗干净去掉叶梗，花序105 ℃杀青5 min，80 ℃烘至恒重，以粉碎机粉碎，过60目筛，粉末置于干燥器中备用。
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图 1 孝感市大悟县野菊花样品采样分布图Figure 1. Sampling and distribution map of C. indicum L. in Dawu County, Xiaogan City1.2.2 野菊花蒙花苷的提取
精密称取一定量经过预处理的野菊花样品，置于100 mL具塞三角瓶中，加入一定量的溶剂，设定温度及提取时间，采取回流法进行野菊花蒙花苷的提取[29]。将回流提取后的样品置于离心管离心，测量上清液体积，并取少量样液过0.22 μm微孔滤膜,滤液稀释10或20倍，以备后续进行HPLC分析。
1.3 提取工艺优化
工艺优化实验均以第27号采集样本为材料，进行蒙花苷的提取和含量测定。
1.3.1 单因素实验
称取一定量的野菊花粉末，在其他条件保持不变的情况下，进行回流提取，分别考察溶剂种类、溶质质量分数、提取时间、液料比、提取温度等因素对蒙花苷得率的影响。
1.3.1.1 溶剂种类对蒙花苷得率的影响
称取野菊花干粉样品0.05 g，选择甲醇、乙醇两种溶剂提取，确定溶质质量分数为60%、液料比为200:1（mL/g），在60 ℃下回流提取30 min，提取液处理后测量蒙花苷浓度并通过计算得出蒙花苷得率，以确定较优溶剂种类。
1.3.1.2 溶质质量分数对蒙花苷得率的影响
称取野菊花干粉样品0.05 g，设置溶质质量分数梯度为30%、40%、50%、60%、70%，确定溶剂为乙醇，在提取温度为60 ℃、液料比为200:1（mL/g）、回流提取时间为30 min的条件下，进行回流提取，提取液处理后测量蒙花苷浓度，计算得出蒙花苷得率，以确定较优溶质质量分数。
1.3.1.3 提取时间对蒙花苷得率的影响
称取野菊花干粉样品0.05 g，设置提取时间梯度为15、30、45、60、75 min，确定溶剂为60%的乙醇，在提取温度为60 ℃、液料比为200:1（mL/g）的条件下，回流提取，提取液处理后测量蒙花苷浓度，计算得出蒙花苷得率，以确定较优提取时间。
1.3.1.4 液料比对蒙花苷得率的影响
称取野菊花干粉样品0.2 g，设置液料比梯度为50:1、100:1、150:1、200:1、250:1（mL/g），确定溶剂为60%的乙醇，在提取温度为60 ℃的条件下，回流提取30 min，提取液处理后测量蒙花苷浓度，计算得出蒙花苷得率，以确定较优液料比。
1.3.1.5 提取温度对蒙花苷得率的影响
称取野菊花干粉样品0.2 g，设置温度梯度为40、50、60、70、80 ℃，确定溶剂为60%的乙醇，在液料比为200:1（mL/g）的条件下，回流提取30 min，提取液处理后测量蒙花苷浓度，计算得出蒙花苷得率，以确定较优提取温度。
1.3.2 响应面试验
基于单因素实验优化的结果，采用Design Expert 8，进行Box-Behnken方法设计4因素3水平响应面试验，因素与水平设计见表1。根据响应面构建的数据模型确定最优的提取工艺参数。
表 1 响应面试验因素水平设计Table 1. Factors and levels of response surface experiment因素 水平 −1 0 1 A溶质质量分数（%） 40 50 60 B提取时间（min） 30 45 60 C液料比（mL/g） 150:1 200:1 250:1 D提取温度（℃） 60 70 80 1.4 蒙花苷含量测定
1.4.1 色谱条件
C18反向色谱柱（Agilent TC-C18 250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（体积比为57:43:0.04）；检测波长：326 nm[30]；柱温箱：25 ℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测时间：15 min。
1.4.2 标准曲线的建立
精密量取蒙花苷标准品，用甲醇溶解制成10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1 mg/L系列浓度的标准品溶液，采用高效液相色谱法测定，以标准品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，以峰面积（y）对标准品浓度（x）进行回归分析，得到方程：y=24109.86x+460.47，其决定系数R2=0.99996，用此方程可以精确计算出野菊花样本中蒙花苷的浓度与含量。
1.4.3 蒙花苷得率的计算
以HPLC分析，积分计算样品溶液蒙花苷吸收峰面积，带入标准曲线方程计算蒙花苷浓度。
蒙花苷得率（%）
=c×V×n1000×m×100 式中：c：样品蒙花苷浓度（mg/mL）；V：样品溶液总体积（mL）；n：稀释倍数；m：野菊花粉末质量（g）。
1.5 孝感市大悟县不同地区野菊化蒙花苷含量测定
采用1.3.2响应面实验优化的工艺参数，对大悟县各地121份野菊花样品进行蒙花苷含量测定，以确定最有利于大悟县野菊花蒙花苷生成并积累的种植区域。
1.6 数据分析
所有样品测量数据至少3个平行样，以算术平均值表示，方差分析（ANOVA）采用IBM SPSS Statistics 24进行Duncan检验，P值小于0.05表示数据之间的差异具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 溶剂种类对蒙花苷得率的影响
野菊花蒙花苷得率受溶剂种类影响的结果如图2所示。3次平行实验平均得率分别为甲醇：1.921%；乙醇：1.804%，经单因素方差分析，两者差异并不显著（P>0.05）。因此将价格更低的乙醇作为最优提取溶剂。
2.1.2 溶质质量分数对蒙花苷得率的影响
野菊花蒙花苷得率受溶质质量分数影响的结果如图3所示。当乙醇质量分数处于30%~60%时，野菊花样本蒙花苷的得率随质量分数的增大而提高；当质量分数大于60%时，蒙花苷得率随乙醇质量分数的提升反而下降。推测原因可能是过高的乙醇质量分数使得蒙花苷的溶出率已趋近饱和，同时使得其他醇溶性物质的溶出增多，导致蒙花苷得率反而下降的情况出现。综合考虑，40%~60%为较优的溶质质量分数。
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图 3 溶质质量分数对蒙花苷得率的影响Figure 3. Effect of solute mass fraction on the yield of buddleoside2.1.3 提取时间对蒙花苷得率的影响
野菊花蒙花苷得率受提取时间影响的结果如图4所示。在45 min以前，样本中蒙花苷的得率随提取时间的增加而增加，并在45 min处达到峰值，而在45 min之后，得率反而会随提取时间的增加而下降，推测可能是蒙花苷的温度稳定性不强[30]，长时间的回流提取导致了蒙花苷的降解，或长时间的提取导致样品中其余成分大量溶出，使蒙花苷得率降低。由此可见，45 min为较优提取时间。
2.1.4 液料比对蒙花苷得率的影响
野菊花蒙花苷得率受液料比影响的结果如图5所示。随着溶剂体积的上升，得率逐渐增大，并当溶剂与干粉的比值为200:1（mL/g）时，得率达到最高点。随后，蒙花苷得率随液料比的进一步增大而开始下降，可能原因是蒙花苷的溶出已达到饱和，溶剂体积的进一步增加，促进了样品中其他成分的溶出。因此，200:1（mL/g）是较为优异的液料比。
2.1.5 提取温度对蒙花苷得率的影响
野菊花蒙花苷得率受提取温度影响的结果如图6所示。当提取温度低于60 ℃时，蒙花苷的得率随温度上升而增加，在60 ℃时达到峰值，并会随温度的进一步提升而下降。分析原因可能是，蒙花苷属于热敏感性化合物[31-32]，较高的提取温度会破坏蒙花苷结构，导致降解。因此，60 ℃为较优提取温度，后续考察60~80 ℃。
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图 6 提取温度对蒙花苷得率的影响Figure 6. Effect of extraction temperature on the yield of buddleoside2.2 响应面分析
2.2.1 响应面试验优化结果
采用Design Expert 8软件进行分析，将表2中的实验数据进行多元方程拟合，得到野菊化蒙花苷得率Y方程如下：
表 2 响应面实验设计和结果Table 2. Experimental design and results of the response surface experiment实验号 A B C D Y蒙花苷得率（%） 1 0 1 1 0 1.75 2 0 −1 1 0 1.94 3 −1 0 −1 0 1.81 4 1 0 −1 0 1.86 5 0 1 0 1 2.38 6 0 0 1 −1 1.69 7 0 0 −1 1 2.35 8 0 −1 0 1 1.91 9 0 1 0 −1 1.70 10 0 −1 −1 0 1.79 11 −1 0 0 1 1.76 12 0 0 0 0 2.01 13 1 0 0 −1 1.20 14 1 1 0 0 1.79 15 0 0 0 0 1.96 16 −1 0 1 0 1.80 17 0 1 −1 0 2.50 18 0 0 0 0 2.10 19 −1 −1 0 0 1.69 20 1 0 −1 0 1.61 21 −1 0 0 −1 1.74 22 1 −1 0 0 1.60 23 −1 1 0 0 1.84 24 1 0 0 1 2.00 25 0 0 0 0 1.99 26 0 0 0 0 2.00 27 0 −1 0 −1 1.68 28 0 0 −1 −1 1.82 29 0 0 1 1 2.06 Y=2.01−0.048A+0.11B−0.11C+0.22D+8.75×10−3AB−0.059AC+0.2AD−0.22BC+0.11BD−0.041CD−0.26A2−0.03B2+0.023C2−0.064D2
由表3可知，回归模型F=48.06，P<0.0001，差异达到极显著水平。模型的决定系数R2=0.9796，调整决定系数R2adj=0.9592，说明该模型可以应用于解释95.92%的因变量变化情况，拟合度较高，实验误差较小。失拟项P=0.5875，大于0.05，差异不显著，说明未知因素对实验结果的影响较小，表明模型选择合适，可以应用于对野菊花蒙花苷提取工艺优化进行分析。回归方程中一次项A（溶质质量分数）、B（提取时间）、C（液料比）、D（提取温度）对样品中蒙花苷得率的影响均达到了极显著水平（P<0.01），其中影响主次因素为D>B>C>A；交互项AD（溶质质量分数与提取温度）、BC（提取时间与液料比）、BD（提取时间与提取温度）三项对得率的影响均达到极显著水平（P<0.01），其中影响效果BC>AD>BD；交互项AC（溶质质量分数与液料比）为显著水平（P<0.05）；二次项A2、D2均达到极显著水平（P<0.01），其中A2>D2。
表 3 响应面回归方程方差分析Table 3. Variance analysis of response surface regression equation方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1.80 14 0.13 48.06 <0.0001 ** A 0.028 1 0.028 10.35 0.0062 ** B 0.15 1 0.15 55.72 <0.0001 ** C 0.14 1 0.14 50.44 <0.0001 ** D 0.57 1 0.57 213.00 <0.0001 ** AB 0.0003062 1 0.003063 0.11 0.7404 AC 0.014 1 0.014 5.28 0.0375 * AD 0.15 1 0.15 57.31 <0.0001 ** BC 0.2 1 0.2 75.01 <0.0001 ** BD 0.05 1 0.05 18.63 0.0007 ** CD 0.006642 1 0.006642 2.48 0.1378 A2 0.45 1 0.45 169.09 <0.0001 ** B2 0.005893 1 0.005893 2.20 0.1604 C2 0.003426 1 0.003426 1.28 0.2773 D2 0.027 1 0.027 9.91 0.0071 ** 残差 0.038 14 0.002682 失拟项 0.026 10 0.002614 0.92 0.5875 误差 0.011 4 0.002849 总变异 1.84 28 决定系数 0.9796 调整决定系数 0.9592 注：**表示差异达到极显著水平（P<0.01），*表示差异达到显著水平（P<0.05）。 2.2.2 工艺优化及结果验证
在其他试验因素不变的情况下，考察A、B、C、D各试验因素之间的交互项对得率的影响，结果如图7所示。响应面图坡度越陡表示响应值受该因素的影响越大[33]。在交互项对得率的影响中，当其他因素保持在零水平时，溶质质量分数的改变并不能显著影响提取时间（AB）对得率的影响，反之也成立；液料比的改变也不能显著影响到提取温度（CD）对得率的影响，反之也成立。这说明溶质质量分数与提取时间、液料比与提取温度之间的交互作用并不明显，但其他因素之间交互作用显著，这与方差分析结果一致。
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图 7 各因素之间交互作用对蒙花苷得率的影响Figure 7. Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of buddleoside通过响应面试验优化得出最优提取条件为：回流溶质质量分数54.13%、提取时间60 min、液料比为150:1（mL/g）、提取温度为80 ℃，得率预测值为2.80%。根据实际情况将最优处理条件中溶质质量分数由54.13%调整为54%，在此最优条件下进行3次水平实验，平均得率为2.75%±0.03%，实际结果与预测结果相对误差为1.82%（<5%），说明实际值与预测值之间无显著差异。证明了该模型与实际情况拟合度高，能够指导实际生产。
2.3 方法可行性分析
2.3.1 重复性实验
精密称取同一样品野菊花干粉0.1 g，按上述最优工艺参数进行回流提取，提取液取6份供HPLC分析，蒙花苷得率经计算结果为2.75%±0.03%，表明重复性较好。
2.3.2 稳定性实验
以最优工艺参数制作供试品溶液，置于室温保存，分别于0、3、6、9、12 h进样检测，记录蒙花苷色谱峰峰面积，通过色谱峰面积计算各样品间的相对标准偏差，所得结果RSD=3.7615%（<5%），表明供试提取液在室温下12 h内稳定。
2.3.3 加标回收率验证
精密称取0.1 g野菊花粉末置于三角烧瓶中，分别加入4、2、1 mg蒙花苷标准品。样品在上述最优处理参数下进行回流提取，提取液经HPLC分析，计算其得率及加标回收率。结果如表4所示，不同浓度的3个水平样品加标回收率均达到80%以上，证明该最优方案能够有效地将样品中的大部分蒙花苷提取出来，具有实际应用价值。
表 4 蒙花苷的加标回收结果Table 4. Results of standard recoveries of buddleoside水平 加标量（mg） 回收量（mg） 回收率（%） 1 4 3.48 87 2 2 1.71 86 3 1 0.81 81 2.4 孝感市大悟县不同地区野菊花蒙花苷含量测定
通过响应面试验优化的最优实验方案，对大悟县不同区域实地取样的野菊花样本进行蒙花苷提取测定，具有代表性的野菊花提取液的高效液相色谱图如图8所示。
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图 8 蒙花苷的高效液相色谱图注：A为蒙花苷标准品；B为33号野菊花样品回流提取液。Figure 8. Liquid chromatograms of buddleoside各区域野菊花样本中蒙花苷的提取测定结果如表5所示。由表5可知，不同区域的野菊花蒙花苷含量差异较为明显，取样地027、037、060、094蒙花苷含量最高，均超过了2.5%（分别为2.75%、2.54%、2.52%、2.51%），为野菊花积累蒙花苷的最优种植区域。此外，取样点015、036、038、040、041、042、049、061、067、068、069、073、111野菊花样品蒙花苷含量均达到了2.00%以上，为较优种植区域。
表 5 大悟县不同区域野菊花样品中的蒙花苷含量结果Table 5. Content of buddleoside in C. indicum L. from different regions of Dawu County编号 含量（%） 编号 含量（%） 编号 含量（%） 编号 含量（%） 001 1.94 032 0.55 063 1.73 094 2.51 002 1.86 033 1.86 064 0.02 095 1.09 003 1.77 034 0.67 065 0.00 096 0.00 004 1.87 035 1.23 066 1.43 097 0.62 005 0.01 036 2.12 067 2.03 098 1.85 006 0.00 037 2.54 068 2.09 099 0.02 007 1.46 038 2.32 069 2.18 100 1.45 008 0.37 039 1.37 070 1.75 101 1.90 009 0.00 040 2.19 071 0.00 102 0.37 010 0.94 041 2.06 072 0.00 103 1.39 011 0.19 042 2.06 073 2.00 104 1.49 012 0.02 043 0.00 074 1.75 105 1.44 013 0.63 044 0.05 075 1.20 106 0.01 014 0.01 045 0.11 076 1.45 107 0.91 015 2.09 046 0.00 077 1.47 108 0.00 016 1.78 047 1.96 078 1.34 109 0.00 017 1.84 048 0.02 079 1.53 110 1.43 018 0.96 049 2.21 080 0.07 111 2.32 019 0.25 050 1.23 081 0.33 112 1.66 020 1.79 051 1.37 082 1.72 113 1.70 021 1.83 052 0.40 083 0.00 114 0.00 022 0.00 053 0.01 084 1.64 115 0.00 023 1.53 054 1.73 085 0.01 116 0.02 024 0.00 055 0.95 086 1.22 117 0.69 025 0.00 056 0.61 087 1.91 118 0.16 026 0.71 057 0.00 088 0.00 119 1.36 027 2.75 058 0.02 089 0.16 120 0.12 028 1.60 059 0.01 090 0.00 121 1.93 029 0.00 060 2.52 091 0.01 030 0.63 061 2.01 092 0.00 031 1.09 062 1.87 093 1.64 3. 结论
本研究在单因素实验分析的基础上，通过Box-Behnken设计了响应面试验，建立了野菊花蒙花苷成分提取的多元回归模型，以此确定野菊花蒙花苷最优提取工艺条件为乙醇质量分数54%、液料比150:1（mL/g）、回流温度80 ℃、回流提取时间60 min，在此工艺条件下，野菊花蒙花苷得率为2.75%±0.03%，与模型预测最大值2.80%无显著性差异。且模型调整决定系数R2adj=0.9592，证明此优化方案可应用于实际生产。
在加标回收实验中，3个不同浓度水平下的回收率均达到80%以上，结合稳定性实验与重复性实验，系统证明了该优化方案具有可行性。以优化方案测定孝感市大悟县不同地区野菊花样品蒙花苷含量，结果显示：027、037、060、094号取样地蒙花苷含量最高，均达到2.5%以上，为积累蒙花苷的最优种植区域，015、036、038、040、041、042、049、061、067、068、069、073、111号区域样品蒙花苷含量达到了2.0%以上，为较优种植区域。本研究成果对大悟县种植富含蒙花苷的野菊花具有重要指导意义，同时为该地区野菊花生产加工、蒙花苷提取工业化制备提供有力参考。
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图 1 孝感市大悟县野菊花样品采样分布图
Figure 1. Sampling and distribution map of C. indicum L. in Dawu County, Xiaogan City
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图 3 溶质质量分数对蒙花苷得率的影响
Figure 3. Effect of solute mass fraction on the yield of buddleoside
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图 6 提取温度对蒙花苷得率的影响
Figure 6. Effect of extraction temperature on the yield of buddleoside
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图 7 各因素之间交互作用对蒙花苷得率的影响
Figure 7. Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of buddleoside
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图 8 蒙花苷的高效液相色谱图
注：A为蒙花苷标准品；B为33号野菊花样品回流提取液。
Figure 8. Liquid chromatograms of buddleoside
表 1 响应面试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
因素 水平 −1 0 1 A溶质质量分数（%） 40 50 60 B提取时间（min） 30 45 60 C液料比（mL/g） 150:1 200:1 250:1 D提取温度（℃） 60 70 80 
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表 2 响应面实验设计和结果
Table 2 Experimental design and results of the response surface experiment
实验号 A B C D Y蒙花苷得率（%） 1 0 1 1 0 1.75 2 0 −1 1 0 1.94 3 −1 0 −1 0 1.81 4 1 0 −1 0 1.86 5 0 1 0 1 2.38 6 0 0 1 −1 1.69 7 0 0 −1 1 2.35 8 0 −1 0 1 1.91 9 0 1 0 −1 1.70 10 0 −1 −1 0 1.79 11 −1 0 0 1 1.76 12 0 0 0 0 2.01 13 1 0 0 −1 1.20 14 1 1 0 0 1.79 15 0 0 0 0 1.96 16 −1 0 1 0 1.80 17 0 1 −1 0 2.50 18 0 0 0 0 2.10 19 −1 −1 0 0 1.69 20 1 0 −1 0 1.61 21 −1 0 0 −1 1.74 22 1 −1 0 0 1.60 23 −1 1 0 0 1.84 24 1 0 0 1 2.00 25 0 0 0 0 1.99 26 0 0 0 0 2.00 27 0 −1 0 −1 1.68 28 0 0 −1 −1 1.82 29 0 0 1 1 2.06
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表 3 响应面回归方程方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 1.80 14 0.13 48.06 <0.0001 ** A 0.028 1 0.028 10.35 0.0062 ** B 0.15 1 0.15 55.72 <0.0001 ** C 0.14 1 0.14 50.44 <0.0001 ** D 0.57 1 0.57 213.00 <0.0001 ** AB 0.0003062 1 0.003063 0.11 0.7404 AC 0.014 1 0.014 5.28 0.0375 * AD 0.15 1 0.15 57.31 <0.0001 ** BC 0.2 1 0.2 75.01 <0.0001 ** BD 0.05 1 0.05 18.63 0.0007 ** CD 0.006642 1 0.006642 2.48 0.1378 A2 0.45 1 0.45 169.09 <0.0001 ** B2 0.005893 1 0.005893 2.20 0.1604 C2 0.003426 1 0.003426 1.28 0.2773 D2 0.027 1 0.027 9.91 0.0071 ** 残差 0.038 14 0.002682 失拟项 0.026 10 0.002614 0.92 0.5875 误差 0.011 4 0.002849 总变异 1.84 28 决定系数 0.9796 调整决定系数 0.9592 注：**表示差异达到极显著水平（P<0.01），*表示差异达到显著水平（P<0.05）。
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表 4 蒙花苷的加标回收结果
Table 4 Results of standard recoveries of buddleoside
水平 加标量（mg） 回收量（mg） 回收率（%） 1 4 3.48 87 2 2 1.71 86 3 1 0.81 81
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表 5 大悟县不同区域野菊花样品中的蒙花苷含量结果
Table 5 Content of buddleoside in C. indicum L. from different regions of Dawu County
编号 含量（%） 编号 含量（%） 编号 含量（%） 编号 含量（%） 001 1.94 032 0.55 063 1.73 094 2.51 002 1.86 033 1.86 064 0.02 095 1.09 003 1.77 034 0.67 065 0.00 096 0.00 004 1.87 035 1.23 066 1.43 097 0.62 005 0.01 036 2.12 067 2.03 098 1.85 006 0.00 037 2.54 068 2.09 099 0.02 007 1.46 038 2.32 069 2.18 100 1.45 008 0.37 039 1.37 070 1.75 101 1.90 009 0.00 040 2.19 071 0.00 102 0.37 010 0.94 041 2.06 072 0.00 103 1.39 011 0.19 042 2.06 073 2.00 104 1.49 012 0.02 043 0.00 074 1.75 105 1.44 013 0.63 044 0.05 075 1.20 106 0.01 014 0.01 045 0.11 076 1.45 107 0.91 015 2.09 046 0.00 077 1.47 108 0.00 016 1.78 047 1.96 078 1.34 109 0.00 017 1.84 048 0.02 079 1.53 110 1.43 018 0.96 049 2.21 080 0.07 111 2.32 019 0.25 050 1.23 081 0.33 112 1.66 020 1.79 051 1.37 082 1.72 113 1.70 021 1.83 052 0.40 083 0.00 114 0.00 022 0.00 053 0.01 084 1.64 115 0.00 023 1.53 054 1.73 085 0.01 116 0.02 024 0.00 055 0.95 086 1.22 117 0.69 025 0.00 056 0.61 087 1.91 118 0.16 026 0.71 057 0.00 088 0.00 119 1.36 027 2.75 058 0.02 089 0.16 120 0.12 028 1.60 059 0.01 090 0.00 121 1.93 029 0.00 060 2.52 091 0.01 030 0.63 061 2.01 092 0.00 031 1.09 062 1.87 093 1.64
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