Optimization of Protein Extraction from Tuna Cooking Liquid and Its Property Analysis
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摘要: 为了对金枪鱼加工行业高氮废水的综合利用提供科学依据，同时为该行业污染减排提供理论指导。在单因素实验基础上，通过响应面试验研究了料液比、温度、时间、pH、固形物含量对乙醇法提取金枪鱼蒸煮液蛋白的影响，并对提取的蛋白采用紫外扫描、红外光谱、氨基酸分析仪和圆二色谱进行结构表征。结果表明，最优提取工艺条件为温度36 ℃，时间2 h，料液比2.40，该条件下蒸煮液蛋白提取率为76.83%。该工艺提取的蛋白在波长218 nm左右处有最大吸收峰，但在280 nm处无明显吸收峰；氨基酸组成显示亚氨基酸质量分数为18.79%，其中羟脯氨酸含量为10.21%；其红外图谱具有明胶红外光谱特征吸收峰，以上结果说明采用该工艺从蒸煮液中提取的蛋白为明胶。Abstract: In order to provide scientific basis for the comprehensive utilization of high nitrogen waste water from tuna processing industry. Besides, it can provide theoretical guidance for pollution reduction in the industry. On the basis of single factor experiment, the effects of liquid-to-material ratio, temperature, time, pH, and solid content on the ethanol extraction of tuna cooking liquid protein were studied by response surface test. Further, the structure of the extracted protein was characterized by Ultraviolet Scanning, Infrared Spectroscopy, Aamino Acid Analyzer and Circular Dichroism. The results showed that the optimal process conditions were temperature 36 ℃, time 2 h, liquid-to-material ratio 2.4, and the maximum protein extraction rate was 76.83%. The protein extracted by this method had the maximum absorption peak at about 218 nm, but no obvious absorption peak at 280 nm. The amino acid composition showed that the mass fraction of amino acids was 18.79%, and the content of hydroxyproline was 10.21%. The infrared spectrum had the characteristic absorption peak of gelatin. The above results indicate that the protein extracted from the cooking liquid by this process is gelatin.
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Keywords:
- tuna /
- tuna cooking liquid /
- gelatin /
- optimization /
- structure characterization
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金枪鱼是大洋暖水性洄游鱼类，广泛分布于世界中低纬度的近海、外海和大洋等地，是重要的经济鱼种[1]，主要用于制作罐头、鱼干等产品。蒸煮是金枪鱼加工过程中的主要步骤之一，每加工1 t原料，将产生0.5 t左右的蒸煮液[2-3]。蒸煮液成分复杂，主要包括蛋白质、游离氨基酸、肽类、糖、脂类等物质[4]。这些蒸煮液由于量大且难以储存，往往得不到妥善地处理，一般直接排放，既造成资源的巨大浪费，又造成严重的环境污染。
有研究发现，通过添加外源蛋白酶从低值的鱼蒸煮液中制备多肽，可以得到营养价值高且必需氨基酸含量丰富的多肽，可用作保健食品、医药等领域的新型原料[5]。林云等[6]以鲭鱼罐头生产过程中产生的蒸煮液为原料，采用复合酶分段酶解技术获得不同相对分子质量的生物活性肽，并研究了其抗氧化活性和血管紧张素转化酶抑制活性。此外，课题组前期研究发现，向金枪鱼加工蒸煮液中加入一定体积的无水乙醇后，可以沉淀出大量的蛋白，经简单表征后发现该蛋白的性质和明胶极为相似。明胶是胶原水解后的产物，属于一种大分子的亲水胶体。鱼明胶作为生物聚合物之一，被认为是哺乳动物明胶的优良替代品[7]，且由于其独特的功能特性，可广泛应用于食品、医药及化妆品等领域。如因其安全、经济、无副作用等特点，具有弱抗原性、生物可降解性及对血小板的凝聚作用，近年来也逐渐应用于治疗创伤和烧伤修复的材料等[8]。
因此，从蒸煮液中提取蛋白对于水产加工企业废弃液的环保化、高值化开发具有重要意义。但目前对于从金枪鱼蒸煮液中提取蛋白并对蛋白进行表征方面的研究鲜见报道。鉴于此，本实验对金枪鱼蒸煮液中蛋白的提取工艺进行优化，在单因素实验的基础上，利用响应面分析法优化提取条件，并通过傅立叶红外扫描、紫外扫描分析、圆二色谱分析、氨基酸分析等方法对其结构进行表征。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
金枪鱼蒸煮液 浙江省宏利达有限公司；无水乙醇、石油醚 分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；盐酸 分析纯，烟台远东精细化工有限公司；氢氧化钠 分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司；苯酚、福林酚 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；浓硫酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
FDU-1200真空冷冻干燥机 东京理化器械株式会社；Nicolet傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo公司；J-1500圆二色光谱仪 日本JASCO公司；UV-6100紫外分光光度计 上海美普达仪器有限公司； S-433D全自动氨基酸分析仪 德国Sykam公司；CT14RDⅡ高速台式冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蒸煮液成分测定
将鱼蒸煮液解冻后过300目筛绢，测定其基本组成成分。灰分含量测定：GB 5009.4-2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；盐度：JG 761-2016《电极式盐度计检定规程》，盐度计测定；总脂肪含量测定：GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》；总糖含量测定[9]：苯酚-硫酸显色法；蛋白质含量测定[10-11]：凯氏定氮法、Folin-酚试剂法。
1.2.2 蒸煮液蛋白提取工艺
取适量金枪鱼蒸煮液，按一定料液比加入无水乙醇，分别在不同温度下搅拌反应一定时间，反应结束后，4000 r/min离心15 min，取沉淀加入一定量的去离子水复溶，4000 r/min离心15 min，将上清液真空冷冻干燥后得蒸煮液蛋白，粉碎后对其进行结构表征分析。
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 pH对提取率的影响
在料液比1:2.5 mL/mL、提取时间3 h、固形物含量10%、室温（25 ℃）的条件下，考察pH2.0、4.0、6.0、8.0、10.0对蒸煮液蛋白提取率的影响。
1.2.3.2 料液比对提取率的影响
在提取时间3 h、原始pH6.32、固形物含量10%、室温（25 ℃）的条件下，考察料液比（v（样品）:v（乙醇）=1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0、1:2.5、1:3.0、1:3.5 mL/mL）对蒸煮液蛋白提取率的影响。
1.2.3.3 温度对提取率的影响
在料液比1:2.5 mL/mL、提取时间3 h、原始pH6.32、固形物含量10%的条件下，考察提取温度25、30、35、40、45、50 ℃对蒸煮液蛋白提取率的影响。
1.2.3.4 固形物含量对提取率的影响
对蒸煮液进行减压浓缩或稀释，获得不同固形物含量样品，在料液比1:2.5 mL/mL、提取时间3 h、原始pH6.32、温度35 ℃的条件下，考察固形物含量10%、20%、30%、40%对蒸煮液蛋白提取率的影响。
1.2.3.5 提取时间对提取率的影响
在料液比1:2.5 mL/mL、原始pH6.32、固形物含量10%、温度35 ℃的条件下，考察提取时间0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h对蒸煮液蛋白提取率的影响。
1.2.4 响应面试验设计
在单因素实验的基础上，选取温度、时间、料液比3个因素，以蛋白提取率为响应值，进行Box-Behnken试验设计[12-14]。响应面试验设计因素与水平设计见表1。
表 1 响应面试验设计因素水平表Table 1. Factors and levels table of response surface experiment因素 水平 −1 0 1 A温度（℃） 30 35 40 B时间（h） 2 3 4 C料液比（mL/mL） 1:1.5 1:2.0 1:2.5 1.2.5 蒸煮液蛋白结构表征
1.2.5.1 氨基酸组成分析
氨基酸组成分析：参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[15]，采用氨基酸自动分析仪对其进行分析。
1.2.5.2 紫外（Ultraviolet, UV）扫描分析
参考赵苍碧等[16]的方法，将样品置于紫外-可见光扫描仪上进行180～300 nm波长范围内扫描。
1.2.5.3 傅里叶红外（Fourier Transform Infrared, FTIR）光谱分析
参考ZHU等[17]的方法，采用傅里叶变换红外光谱仪对样品在500～4000 cm−1区间扫描。
1.2.5.4 圆二色谱（Circular Dichroism, CD）分析
参考WANG等[18]的方法，取适量样品溶液置于光程为1 mm的样品池中进行扫描分析。扫描波数为190~260 nm，温度为4 ℃。
1.3 数据处理
利用Excel、Origin 9.0软件和Design Expert 8数据处理系统进行数据分析。实验数据取3次平均值，以折线图形式表现结果。
2. 结果与分析
2.1 蒸煮液成分分析
测定金枪鱼蒸煮液中蛋白质、总糖、灰分、盐度、油脂含量，结果如表2所示。从实验数据分析可得，金枪鱼蒸煮液中蛋白质含量较高为25.51%，是优质蛋白质提取的理想原料。粗脂肪含量为14.4%，据相关文献报道[19]，金枪鱼中脂肪多属于不饱和脂肪酸，利于心血管疾病的预防，还含有少量总糖和灰分，分别占比3.57%、2.45%。
表 2 金枪鱼蒸煮液基本成分含量Table 2. Content of basic components in tuna cooking liquid成分 灰分 盐度 油脂 总糖 蛋白质 含量（%） 2.45 2.08 14.4 3.57 25.51 2.2 蒸煮液蛋白提取实验
2.2.1 pH对蛋白提取的影响
由图1可知，随着pH的增大，蒸煮液蛋白提取率呈现先升高后下降的趋势，在pH4.0和6.0时其提取率最高为53.22%、55.09%。当pH为8.0和10.0时，其提取率有所降低，但不明显，分别为50.18%、45.05%。当pH为2.0时，其提取率明显降低，为23.66%。因此推测该蛋白的等电点可能在4.0~6.0之间，当蛋白质溶液pH处于等电点时，蛋白质分子表面不带电荷呈电中性，分子间的斥力减弱，容易受静电引力影响聚集而产生沉淀[20]。
2.2.2 料液比对蛋白提取的影响
由图2可知，随着料液比的增加，蒸煮液蛋白提取率逐渐增大，料液比为1:2.5 mL/mL时，蛋白质提取率为61.44%，相较于料液比为1:1.5 mL/mL时提升了两倍，可知料液比对蛋白提取率影响较大。因为随着料液比增大，蒸煮液与乙醇的接触面积增大，提高了蛋白质扩散速度，从而提高了蛋白提取率[21]。继续扩大料液比，蛋白提取率变化趋于平缓，可能是因为乙醇过量，蛋白质扩散趋于饱和，因此蛋白提取率变化不明显。
2.2.3 温度对蛋白提取的影响
由图3可知，随着温度的升高，蛋白质提取率呈小幅度先升后降趋势，在35 ℃时达到最高，原因可能是温度过高蛋白质开始逐步变性，因此选择35 ℃为蒸煮液蛋白最适提取温度。
2.2.4 固形物含量对蛋白提取的影响
不同生产厂家，不同加工批次，其蒸煮液中的固形物含量均会存在较大差异，为验证该提取工艺的稳定性，研究不同固形物含量对蛋白提取的影响具有重要意义。如图4所示，固形物含量不同，蛋白质提取率存在一定差异，但都高于60%，说明本工艺可以应用于大部分蒸煮液样品中蛋白的提取。
2.2.5 时间对蛋白提取的影响
由图5可知，当提取时间为0.5~3 h时，蛋白的提取率随着时间的延长而升高，提取时间较短，蛋白沉淀不完全。当提取时间为4 h时，蛋白的提取率略有下降，可能原因是提取时间过长导致蛋白分解[22]，因此选择3 h作为最佳提取时间。
2.3 响应面设计优化
2.3.1 模型的建立与显著性检验
在单因素实验基础上，选取提取温度、时间、料液比3个因素，按照Box-Behnken原理进行响应面设计，试验方案及结果见表3。
表 3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3. Design and results of Box-Behnken experiment试验号 A温度 B时间 C料液比 蛋白质提取率（%） 1 0 0 0 74.11 2 0 1 1 70.66 3 0 0 0 74.02 4 −1 −1 0 68.02 5 0 −1 1 79.04 6 0 1 −1 54.98 7 1 1 0 69.73 8 1 −1 0 69.29 9 −1 0 −1 54.81 10 0 0 0 74.05 11 1 0 −1 39.65 12 0 −1 −1 53.04 13 −1 1 0 73.51 14 1 0 1 74.39 15 0 0 0 74.09 16 0 0 0 74.03 17 −1 0 1 78.24 对实验数据进行多元回归拟合，得到温度、时间、料液比的二次多项回归方程：
Y=74.06−2.69A−0.087B+12.48C−1.26AB+2.83AC−2.58BC−3.29A2−0.63B2−9.00C2
方程的决定系数R2=0.9533，说明方程的拟合度较好，可通过二次方程对实验结果进行分析。
由表4可知，回归模型极显著（P=0.0007<0.01），证明模型可靠，可以用于预测蒸煮液蛋白质提取率。各因素对蛋白质提取率的影响大小顺序为C（料液比）>A（温度）>B（时间）。其中，模型的极显著因子项（P<0.01）为C和C2，可知料液比对蛋白提取的影响极其显著，与单因素结果一致。
表 4 提取工艺回归模型方差分析结果Table 4. Variance analysis results of regression model of extraction process方差来源 平方和 自由度 均方 F P>F 模型 1777.15 9 197.46 15.86 0.0007** A温度 57.89 1 57.89 4.65 0.0680 B时间 0.033 1 0.033 2.611E-003 0.9607 C料液比 1246.25 1 1246.25 100.10 < 0.0001** AB 6.38 1 6.38 0.51 0.4974 AC 31.98 1 31.98 2.57 0.1530 BC 26.63 1 26.63 2.14 0.1870 A2 45.58 1 45.58 3.66 0.0973 B2 1.68 1 1.68 0.14 0.7239 C2 340.86 1 340.86 27.38 0.0012** 残差 87.15 7 12.45 纯误差 6.000E-003 4 1.500E-003 总和 1864.30 16 注：**代表P<0.01，结果极显著。 2.3.2 响应面交互分析
响应面的坡度平缓表示两因素的交互作用不显著，坡度较陡表示两因素交互作用显著。试验中所考察的三个因素对鱼蒸煮液蛋白质提取率影响的交互作用见图6。由图6（a~c）可知，在三组交互作用中，AC（温度和料液比）交互作用最强，其次是BC（时间和料液比）的交互作用，而AB（温度和时间）的交互作用最弱，这与表4显著性检验得到的结果一致。
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图 6 各因素对蛋白质提取率影响的响应面图Figure 6. Response surface map of the effects of various factors on protein extraction rate2.3.3 最佳工艺条件的预测与验证
由Design-Expert 8.0软件计算得出乙醇法提取金枪鱼蒸煮液蛋白的最佳工艺条件：温度35.77 ℃，时间2 h，料液比2.43，蛋白质提取率为79.87%。考虑实际操作，将优化参数修正为提取温度36.00 ℃，时间2 h，料液比2.40。采用修正后的提取条件进行实验，实际提取率为76.83%±0.24%，实验值与预测值在95%置信区间内没有显著差异，表明该响应面优化结果可靠，具有实际参考价值。
2.4 蒸煮液蛋白结构表征
2.4.1 氨基酸组成分析
氨基酸是构成生物体营养组分蛋白质的基本单位，同时也是细胞生长过程中必要的营养成分。蒸煮液蛋白的氨基酸组成见表5，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸含量较高，分别为17.27%、8.09%、8.58%和10.21%，这与从金枪鱼鱼皮中提取的明胶相似[23]。金枪鱼蒸煮液提取的蛋白的亚氨基酸含量为18.79%，与已报道的冷水鱼类明胶中亚氨基酸质量分数在17%左右[24]相符合。
表 5 鱼蒸煮液蛋白氨基酸分析结果Table 5. Amino acid analysis results of fish cooking liquid protein编号 氨基酸 含量（%） 1 Tau 2.05 2 Asp 5.76 3 Thr 3.10 4 Ser 3.05 5 Glu 10.11 6 Gly 17.27 7 Ala 8.09 8 Val 2.77 9 Met 1.93 10 Ile 1.13 11 Leu 2.38 12 Tyr 0.68 13 Phe 1.25 14 Lys 4.71 15 His 8.66 16 Arg 6.61 17 Pro 8.58 18 Hyp 10.21 2.4.2 紫外（UV）扫描分析
通常蛋白质中存在色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，这些氨基酸由于共轭双键的存在，在紫外波长280 nm左右有明显的吸收峰。而明胶中的芳香族氨基酸含量较少，使其在280 nm处的吸收峰不明显[25]。此外，由于明胶中存在C＝O、CONH2、—COOH等发色基团，紫外特征吸收峰通常出现在220 nm左右[26]。从图7可以看出，从金枪鱼蒸煮液中提取的蛋白在218 nm处有较高的吸收峰，而在280 nm处没有明显吸收峰，说明该提取蛋白中的芳香族氨基酸含量较少，与其氨基酸分析结果一致。
2.4.3 傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析
如图8所示，鱼蒸煮液蛋白红外光谱峰具有胶原蛋白的特征振动模式，其酰胺A带、酰胺B带、酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带分别出现在3270.83、2934.72、1632.01、1538.75、1236.97 cm-1，与文献中报道的虹鳟鱼皮胶原蛋白的吸收峰位置一致[27]。酰胺A带、B带的吸收分别与NH键、CH2的伸缩振动有关[28]。酰胺Ⅰ带代表C＝O的伸缩振动，对蛋白质二级结构的变化非常敏感；酰胺Ⅱ带与CH2和NH键的弯曲振动有关；酰胺Ⅲ带与CH2的弯曲振动有关。酰胺A带和酰胺Ⅰ带、Ⅱ带、Ⅲ带与胶原蛋白内部的氢键形成有关，反映了肽链的结构和构象[29]。胶原蛋白水解成明胶的过程即是胶原三螺旋结构解旋并逐渐水解的过程，蒸煮液蛋白质在1236.97 cm-1处出现酰胺III带的吸收峰，说明在蛋白质提取时，三螺旋结构遭到破坏但仍有保留[23]。此外，蒸煮液蛋白在2934.72 cm−1的吸收峰是由C-H键的伸缩振动引起的，1450.19 cm−1的吸收峰是由-CH-、-CH3的弯曲振动引起的，1403.37 cm−1的吸收峰是由-CH2-键的摇摆振动引起的，1079.53 cm−1的吸收峰是由于C-N-C振动或C-O键的伸缩振动，这些吸收峰的存在说明鱼蒸煮液蛋白质属于顺式构型[30]。多肽大部分肽链中的肽单位都是反式构型，只有脯氨酸和羟脯氨酸的残基肽单位是顺式构型[31]，与鱼蒸煮液蛋白氨基酸组成结果相一致（脯氨酸和羟脯氨酸总质量分数为18.79%），这也说明本实验所制得的蛋白为明胶。
2.4.4 圆二色谱（CD）分析
圆二色谱是一种根据光学活性物质对左旋和右旋圆偏振光的吸收差异原理分析蛋白质立体结构的方法[32]。远紫外（190~250 nm）CD谱反映肽键的圆二色性，肽键的排列具有高度规律性，排列的方向决定了肽键能级跃迁的分裂情况，对蛋白在此范围内的谱带位置和吸收强弱进行分析可以判断肽链的立体结构信息[33]。因此，利用远紫外CD对鱼蒸煮液蛋白质的二级结构进行深入分析，将蛋白溶液放入圆二色谱仪中进行光谱扫描结果如图9所示，鱼蒸煮液蛋白在198 nm附近出现明显的吸收峰负峰，但是220 nm处没有出现正峰。据相关文献报道，220 nm处吸收强度可表征三螺旋结构的完整性，当蛋白变性或者三股螺旋结构遭到破坏时，220 nm处吸收峰会发生变化[34]，因此结果表明本研究提取的鱼蒸煮液蛋白三股螺旋结构在高温蒸煮过程中遭到破坏。
3. 结论
采用乙醇法对金枪鱼蒸煮液蛋白进行提取并分析了其结构特性。在单因素实验的基础上，通过响应面试验设计，确定了金枪鱼蒸煮液蛋白的最佳提取工艺条件：提取温度36 ℃，提取时间2 h，料液比2.40，此条件下蒸煮液中蛋白的提取率可达76.83%。氨基酸组成分析结果显示其亚氨基酸质量分数为18.79%，其中羟脯氨酸含量为10.21%；紫外光谱显示其在218 nm处有较高的吸收峰，而在280 nm处没有明显吸收峰；其红外图谱具有胶原蛋白红外光谱特征吸收峰；圆二色谱说明该研究制备的金枪鱼蒸煮液蛋白三螺旋结构被破坏，以上结果说明采用该工艺从金枪鱼蒸煮液中提取的蛋白为明胶。本研究为金枪鱼蒸煮液蛋白的深度开发提供一定的理论依据。
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图 6 各因素对蛋白质提取率影响的响应面图
Figure 6. Response surface map of the effects of various factors on protein extraction rate
表 1 响应面试验设计因素水平表
Table 1 Factors and levels table of response surface experiment
因素 水平 −1 0 1 A温度（℃） 30 35 40 B时间（h） 2 3 4 C料液比（mL/mL） 1:1.5 1:2.0 1:2.5 
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表 2 金枪鱼蒸煮液基本成分含量
Table 2 Content of basic components in tuna cooking liquid
成分 灰分 盐度 油脂 总糖 蛋白质 含量（%） 2.45 2.08 14.4 3.57 25.51
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表 3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment
试验号 A温度 B时间 C料液比 蛋白质提取率（%） 1 0 0 0 74.11 2 0 1 1 70.66 3 0 0 0 74.02 4 −1 −1 0 68.02 5 0 −1 1 79.04 6 0 1 −1 54.98 7 1 1 0 69.73 8 1 −1 0 69.29 9 −1 0 −1 54.81 10 0 0 0 74.05 11 1 0 −1 39.65 12 0 −1 −1 53.04 13 −1 1 0 73.51 14 1 0 1 74.39 15 0 0 0 74.09 16 0 0 0 74.03 17 −1 0 1 78.24
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表 4 提取工艺回归模型方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of regression model of extraction process
方差来源 平方和 自由度 均方 F P>F 模型 1777.15 9 197.46 15.86 0.0007** A温度 57.89 1 57.89 4.65 0.0680 B时间 0.033 1 0.033 2.611E-003 0.9607 C料液比 1246.25 1 1246.25 100.10 < 0.0001** AB 6.38 1 6.38 0.51 0.4974 AC 31.98 1 31.98 2.57 0.1530 BC 26.63 1 26.63 2.14 0.1870 A2 45.58 1 45.58 3.66 0.0973 B2 1.68 1 1.68 0.14 0.7239 C2 340.86 1 340.86 27.38 0.0012** 残差 87.15 7 12.45 纯误差 6.000E-003 4 1.500E-003 总和 1864.30 16 注：**代表P<0.01，结果极显著。
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表 5 鱼蒸煮液蛋白氨基酸分析结果
Table 5 Amino acid analysis results of fish cooking liquid protein
编号 氨基酸 含量（%） 1 Tau 2.05 2 Asp 5.76 3 Thr 3.10 4 Ser 3.05 5 Glu 10.11 6 Gly 17.27 7 Ala 8.09 8 Val 2.77 9 Met 1.93 10 Ile 1.13 11 Leu 2.38 12 Tyr 0.68 13 Phe 1.25 14 Lys 4.71 15 His 8.66 16 Arg 6.61 17 Pro 8.58 18 Hyp 10.21
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