The Process Optimization of Vinegar Roasting of Bupleurum chinense by Entropy Weight Method Combined with Box-Behnken Response Surface Method and Its Protective Effect on Mice Liver Injury
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摘要: 目的：优化醋炙柴胡炮制工艺，探究柴胡醋炙前后对小鼠急性肝损伤的保肝作用。方法：熵权法结合Box-Behnken响应面设计法，对柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、浸出物等指标综合评分，考察醋用量、闷润时间、炒制温度因素，以优化醋炙柴胡炮制工艺。建立对乙酰氨基酚（APAP）诱导小鼠急性肝损伤模型，分析柴胡醋炙前后对小鼠肝功能、炎症、氧化应激的影响。结果：醋柴胡炮制工艺参数为：醋用量23%，闷润时间2.8 h，炒制温度145 ℃，其指标含量分别为柴胡皂苷A 0.65%，柴胡皂苷D 0.74%，浸出物20.67%。醋柴胡组的小鼠血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β水平显著降低（P<0.05），肝组织中的还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶(SOD)均有不同程度的提高，丙二醛(MDA)显著降低（P<0.05）。柴胡组对于GSH-Px和GSH的改善不明显。结论：熵权法结合Box-Behnken响应面法优化北柴胡醋炙的炮制工艺稳定。通过抑制炎症和缓解氧化应激，醋柴胡能够改善急性肝损伤，且效果比柴胡组更显著。Abstract: Objective: The concoction process of vinegar roasted Chai Hu was optimized to investigate the hepatoprotective effect of Chai Hu before and after vinegar roasting on acute liver injury in mice. Methods: Combined with Box-Behnken response surface design method, the entropy weight method was applied. The indices of Saikosaponin A, Saikosaponin D and leachate were comprehensively scored to evaluate the vinegar dosage, smothering and wetting time and frying temperature so as to optimize the vinegar roasting process of Chai Hu. A model of acetaminophen (APAP)-induced acute liver injury in mice was established to analyze the effects on liver function, inflammation and oxidative stress before and after the vinegar roasting of Chai Hu. Results: The process parameters were 23% vinegar, 2.8 h smothering and wetting time and 145 ℃ frying temperature. The index contents were 0.65% Saikosaponin A, 0.74% Saikosaponin D and 20.67% leachate. In the Chai Hu vinegar group, the serum levels of mice were significantly reduced in alanine transaminase (ALT), glutathione transaminase (AST), tumour necrosis factor-α, interleukin-6, and interleukin-1β (P<0.05). In the liver tissues, the levels of glutathione (GSH), glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) increased respectively, and MDA significantly reduced (P<0.05). The Chai Hu group indicated insignificant improvement in GSH-Px and GSH. Conclusion: Entropy weight method combined with Box-Behnken response surface method optimized the process of the concoction of Northern Chai Hu with vinegar roasting was stable. With better effect than that of the Chai Hu group, vinegar Chai Hu can improve acute liver injury through inhibiting inflammation and lessening oxidative stress.
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对乙酰氨基酚（Acetaminophen, APAP）是一种被广泛使用的解热镇痛药物。近年来，在我国对乙酰氨基酚过量使用导致的急性肝损伤呈上升趋势[1-2]。研究已发现天然植物中的苷类、黄酮、多酚、生物碱等成分对急性肝损伤有保护作用[3-4]。
柴胡为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）的干燥根，又称北柴胡。柴胡性微寒，味苦、辛，归肝胆经，具有保肝、抗炎等作用[5]。柴胡在我国应用广泛，不仅用于药用，还可以用于保健，如含有柴胡的药膳（香苏柴荆蒸猪肝）、柴胡保健酒等。中医认为，柴胡有升举阳气、疏肝解郁的功效。在药性五味中，醋以酸味为主，酸味入肝，因此柴胡入肝以醋柴胡为主。研究表明，柴胡醋炙后增强了药效入肝的作用[6-7]，其抗抑郁的效果强于醋炙前[8]，因此增加了醋柴胡在临床上的应用 [9-10]。柴胡醋炙后其皂苷含量发生变化，在醇提液中柴胡皂苷A（Saikosaponin A, SSA）增加，柴胡皂苷D（Saikosaponin D, SSD）减少。有研究表明SSA对脂多糖与D-半乳糖诱导的肝损伤有保护作用[11]，SSD对人肝细胞具有保护作用[12]。而且柴胡成分复杂，醇溶性浸出物中包含了多种有效成分，常被用作质量标准的指标，且柴胡醋炙后浸出物含量会略有增加[13-14]。
目前，大多数省市的炮制规范收录了醋炙柴胡，但其炮制工艺的描述中，对醋炙柴胡醋用量、闷润、炒制等多用适量、文火等专业术语，对具体的炮制工艺参数并不明确，炮制过程中缺乏可量化的工艺参数，导致各省市炮制工艺参数均有差异，不利于饮片规范性生产[15-16]。并且有些省市对醋柴胡皂苷含量的质量标准没有要求，只对其浸出物含量做出了标准，极大的影响了醋制柴胡的质量[17]。以前对于柴胡的工艺优化多数采用正交试验法[18-20]。正交试验主要侧重试验次数与如何科学的安排实验，并且只能分析离散型数据，精度不高，预测性不佳。而响应面法采用非线性模型，能求得高精度的回归方程，进行合理预测来找出最优工艺条件[21]。
熵权法是一种客观赋权法，相对于主观赋权法，精确度高，客观性强[22]。它通过样本数据计算直接得出权重，不受人为主观因素的影响，已经广泛应用于各类药材、植物品质评价中[23-24]。因此，本研究将SSA、SSD、浸出物等作为醋炙工艺的评价指标，采用熵权法计算各指标的综合评分，结合Box-Behnken 设计法确信试验因素对试验指标在非线性影响条件下各因素与指标之间的影响[25]，优化北柴胡醋炙工艺。建立小鼠APAP诱导下急性肝损伤模型，研究柴胡醋炙后对药物性肝损伤的作用变化，为醋柴胡在治疗急性肝损伤的应用上提供一些参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
雄性ICR小鼠 SPF级，体重20~22 g，来源于吉林农业大学实验动物中心，许可证：SYXK(吉)2018-0023，实验动物在室内温度（22±2）℃，相对湿度（55%±5%），的无菌培养室中饲养，保持正常昼夜交替，给予充分的进食和饮水，适应性饲养一周后开始进行实验；柴胡 黑龙江齐齐哈尔肇源县，经吉林省鼎盛药材检验公司鉴定为北柴胡（Bupleurum chinense DC.）的干燥根；柴胡皂苷Ａ对照品 纯度93.2%，批号：110777-201510、柴胡皂苷Ｄ对照品 纯度95.8%，批号：110778-201711 中国食品药品检定研究院；对乙酰氨基酚（Paracetamol, APAP） 阿拉丁试剂有限公司；N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine, NAC） 翌圣生物科技有限公司；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒 南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒 北京诚林生物技术有限公司；其他试剂 分析纯。
HC-2517高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；SPECTRO star Nano全波长扫描式酶标仪 德国BMG LABTECH公司；UltiMate 3000高效液相色谱仪 美国热电公司；CY式滚筒炒药机 康华制药机械有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 生柴胡饮片制备
取北柴胡原药材，除去残茎及杂质、洗净、润透、切厚片、干燥、即得[26]。
1.2.2 醋炙柴胡炮制工艺
北柴胡饮片，置于槽内，加入一定量的米醋，闷润至米醋吸浸，放入炒药机内炒制一定时间，取出、放凉。
1.2.3 SSA、SSD含量的测定
1.2.3.1 色谱条件
色谱柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×250 mm，5 μm，120 Å)；流动相：乙腈(B)-水(A)；洗脱梯度：0~50 min，75%~10% A；50~60 min，10% A；流速：1.0 mL/min；波长：210 nm；柱温为室温，进样量：5 μL。
1.2.3.2 对照品溶液制备
精密称取柴胡皂苷A对照品7.52 mg、柴胡皂苷D对照品9.34 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，备用。
1.2.3.3 供试品溶液的制备
将醋柴胡饮片粉碎后，过药典四号筛。精密称定0.5 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，用封口膜封好瓶塞，密塞，30 ℃水温超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，滤过，用甲醇20 mL分2次洗涤容器及样品，洗液与滤液合并置蒸发皿中，水浴锅加热，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（孔径0.45 μm）滤过，取续滤液置液相小瓶，在“1.2.3.1”色谱条件下检测SSA、SSD含量。
1.2.4 浸出物含量测定
取醋柴胡粉末（过四号筛），精密称取2 g，置于250 mL锥形瓶中，精密加95%乙醇50 mL，密塞，称定重量，静置1 h，连接回流冷凝管，加热至沸腾，保持微沸1 h。放冷后，密塞，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量[27]，计算其浸出物含量。
1.2.5 多指标综合评分法建立
熵权法是确定指标权重的客观赋权法，可用来确定多指标评价系统中各指标权重[28]。设有m个待评价对象，n个评价指标，原始矩阵为X= (Xij) m×n，i=1,2,···, m；j=1, 2, ···, n。对原始矩阵进行标准归一化处理，得到矩阵Y= (Yij) m×n。本实验中m=15，n=3，采用极值法对原始数值进行标准化处理，使矩阵Y中的任一数值处于[0, 1]之间[29]。
式中：Yij为第i个评价对象的第j个评价指标的标准化值；Xij为第i个评价对象的第j个评价指标的原始数值；max Xij和min Xij分别表示第i个评价对象在第j个评价指标上的最大值和最小值。
对统计数据进行标准化后即可计算各指标的信息熵。
其中
式中：Hj为第j个评价指标的熵值；Pij为第i个评价对象在j指标下的概率。
式中：Wj为第j个评价指标的熵权。
SSA、SSD、浸出物的权重分别为0.3318、0.3392、0.3290。综合评分M=SSA含量×0.3318＋SSD含量×0.3392＋浸出物含量×0.3290。
1.2.6 单因素实验
1.2.6.1 醋用量对综合评分的影响
称北柴胡生饮片5份，每份1 kg，分别加入15%、20%、25%、30%、40%的米醋，闷润3 h，于130 ℃炒药机炒制15 min。研究醋用量对综合评分的影响。
1.2.6.2 闷润时间对综合评分的影响
称北柴胡生饮片5份，每份1 kg，加入25%的米醋，分别闷润1、2、3、4、5 h，于130 ℃炒药机炒制15 min。研究闷润时间对综合评分的影响。
1.2.6.3 炒制温度对综合评分的影响
称北柴胡生饮片5份，每份1 kg，加入25%的米醋，闷润3 h，分别于110、120、130、140、150 ℃炒药机炒制15 min。研究炒制温度对综合评分的影响。
1.2.7 响应面试验
1.2.7.1 响应面试验设计
在单因素实验的基础上，以醋用量、闷润时间、炒制温度为考察因素，综合评分M为响应值，运用 Design-Expert 8.0.6 软件的Box-Behnken响应面法设计3因素3水平的试验条件。Box-Behnken响应面法因素水平编码见表1。
表 1 响应面试验的因素和水平Table 1. Factors and levels of response surface testing水平 因素 A 醋用量（%） B 闷润时间（h） C 炒制温度（℃） −1 20 2 130 0 25 3 140 1 30 4 150 1.2.8 柴胡、醋柴胡保肝作用初探
1.2.8.1 药物配制
称取柴胡粉末（过四号筛）20 g，10倍量70%乙醇，浸泡40 min后，采用加热回流的方式提取两次，每次1.5 h，合并两次滤液，水浴蒸干得干浸膏，配制成含柴胡生药3 g·mL−1的水溶液。称取醋柴胡粉末（过四号筛）20 g，以同样的方法制取醋柴胡水溶液，含生药3 g·mL−1，备用。
1.2.8.2 APAP诱导小鼠肝损伤模型建立
取ICR小鼠40只，正常食水适应性饲养7 d后随机分为5组，每组8只。（1）空白对照组（C）；（2）模型对照组（M）；（3）阳性对照组（NAC）；（4）柴胡组（S）；（5）醋柴胡组（VS）。S组每天灌胃柴胡水溶液3 g·kg−1；VS组每天灌胃醋柴胡水溶液3 g·kg−1；C组、M组灌胃同体积的生理盐水；NAC组灌胃150 mg·kg−1N-乙酰半胱氨酸水溶液；连续灌胃7 d，末次给药1 h后给予M组、NAC组、S组、VS组小鼠一次性APAP腹腔注射（250 mg·kg−1）。C组给予腹腔注射同体积的生理盐水，24 h后，进行眼球采血和解剖，造模和解剖前分别保证小鼠禁食不禁水12 h以上[30]。
1.2.8.3 柴胡、醋柴胡对小鼠血清中ALT、AST水平的影响
根据试剂盒说明书检测血清指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。
1.2.8.4 柴胡、醋柴胡对小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响
严格按照ELISA试剂盒中的说明书检测并计算小鼠血清中白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1，β型（Interleukin-1β）的炎症因子水平。
1.2.8.5 柴胡、醋柴胡对小鼠肝组织中GSH、GSH-Px和SOD活性及MDA含量的影响
严格按照试剂盒说明书测定肝脏组织中的丙二醛（MDA）含量、还原型谷胱甘肽（GSH）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力等。
1.2.8.6 H&E染色
取肝脏组织右叶石蜡包埋切片，进行苏木-伊红染色，观察其病理情况。
1.3 数据处理
采用SPSS 23.0数据分析软件对变化显著性分析。使用Excel 2010软件对数据进行统计分析并绘制图表，使用Design Expert 10进行响应面分析。
2. 结果与分析
2.1 SSA、SSD含量测定
2.1.1 标准曲线的绘制
SSA、SSD 的色谱图如图1。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作线性回归方程，得标准曲线，SSA：y=8170532x−82372（r=0.9997）。线性范围：0.376～7.52 μg；SSD：y=10338950x−170696（r=0.9968）。线性范围：0.467～9.34 μg。
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图 1 混合对照品（A）、醋柴胡样品（B）和柴胡样品（C）的色谱图注：1. SSA 2. SSD。Figure 1. Chromatograms of mixed reference（A）, vinegar Chai Hu sample（B）and Chai Hu sample（C）2.2 单因素实验
2.2.1 醋用量对综合评分的影响
当醋量低于20%时，其综合评分较低，可能柴胡饮片无法吸收到陈醋，内部成分不能转化完全；当醋用量为25%时，综合评分最高；超过30%时，在规定时间内，还有剩余陈醋未吸尽；因此选择25%作为响应面试验的中心点，结果见图2A。
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2.2.2 闷润时间对综合评分的影响
闷润时间2 h时，醋被吸尽，但评分较低；闷润时间为3 h时，醋已吸尽，综合评分最高；在4 h和5 h时，评分未有显著变化（P>0.05），故选择3 h为响应面试验的中心点，结果见图2B。
2.2.3 炒制温度对综合评分的影响
120 ℃时，部分水分超过2020版《中国药典》规定的10%，因此舍弃120 ℃；130 ℃时，水分测定合格，符合药典规定，但综合评分较低；140 ℃时，水分合格，饮片颜色淡棕黄色，片型较好，有醋香气，符合药典规定，且综合评分最高；150 ℃时，饮片颜色接近深黄棕色，有焦香气，综合评分降低。因此选择140 ℃为中心点，结果见图2C。
2.3 响应面结果与分析
2.3.1 响应面模型与方差分析
实验设计与结果见表2。对表2进行回归分析，得拟合方程：M=5.43−0.026A−0.09892B+0.016C+0.048AB+0.011AC−0.01024BC−0.048A2−0.57B2−0.011C2。
表 2 Box-Behnken 试验设计与结果Table 2. Box-Behnken trial design and results序号 因素 指标含量（±s） 综合评分M(±s) A醋用量 B闷润时间 C炒制温度 SSA（%） SSD（%） 浸出物（%） 1 1 −1 0 0.64±0.05 0.69±0.10 20.86±0.21 7.057±0.18 2 0 1 −1 0.46±0.03 0.52±0.08 20.25±0.17 7.150±0.15 3 0 1 1 0.47±0.04 0.54±0.09 20.28±0.12 7.194±0.12 4 1 0 −1 0.54±0.04 0.60±0.09 20.57±0.19 7.116±0.16 5 0 0 0 0.63±0.06 0.69±0.11 20.73±0.25 7.283±0.21 6 0 0 0 0.53±0.04 0.55±0.08 20.33±0.09 7.267±0.12 7 −1 1 0 0.62±0.07 0.73±0.14 20.83±0.21 7.077±0.26 8 1 1 0 0.57±0.90 0.67±0.12 20.68±0.19 7.150±0.16 9 −1 −1 0 0.58±0.06 0.67±0.12 20.70±0.28 7.243±0.27 10 0 −1 1 0.53±0.07 0.59±0.08 20.39±0.14 7.213±0.21 11 0 −1 −1 0.58±0.11 0.69±0.13 20.73±0.16 7.164±0.22 12 −1 0 1 0.59±0.09 0.70±0.15 20.75±0.19 7.240±0.22 13 1 0 1 0.65±0.13 0.76±0.13 20.85±0.18 7.187±0.19 14 0 0 0 0.65±0.08 0.74±0.09 20.87±0.21 7.267±0.28 15 −1 0 −1 0.67±0.12 0.75±0.11 20.89±0.22 7.230±0.31 对模型进行方差分析结果见表3。由表3可知，模型极显著P<0.01，失拟项不显著P>0.05。说明模型拟合度好，试验与实际情况较贴合。模型中的A、C极显著P<0.01，单项B显著P<0.05；交互项AB极显著P<0.01；A2、B2极显著P<0.01。由F值可知三个因素对综合评分的影响为醋用量>炒制温度>闷润时间。
表 3 回归模型方差结果Table 3. Regression model variance results方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 0.067 9 0.00747 49.22 0.0002 ** A 0.0098 1 0.00982 64.69 0.0005 ** B 0.0014 1 0.00143 9.44 0.0277 * C 0.0038 1 0.00380 25.02 0.0041 ** AB 0.0169 1 0.01686 111.07 0.0001 ** AC 0.0009 1 0.00091 5.97 0.0585 BC 0.00001 1 0.00001 0.050 0.8326 A2 0.0150 1 0.01502 98.98 0.0002 ** B2 0.0219 1 0.02187 144.12 <0.0001 ** C2 0.00085 1 0.00085 5.62 0.0640 残差 0.0007 5 0.00015 失拟项 0.0006 3 0.00019 2.12 0.3366 净误差 0.00018 2 0.00009 总和 0.068 14 R2=0.9888 Radj2=0.9687 注：*表示显著（P<0.05），**表示极显著（P<0.01 ）。 2.3.2 响应面曲面分析
各因素交互作用对综合评分的影响见图3。响应面坡度越大表明该因素对响应值影响越大，从图3可知各因素对综合评分影响排序为醋用量>炒制温度>闷润时间。从图3A等高线可知闷润时间与醋用量的交互作用对综合评分影响较大；从图3B中可知，炒制温度与醋用量的交互作用较弱；从图3C可知，闷润时间与炒制温度交互作用对综合评分影响较弱。应用软件预测最佳炮制工艺为：醋用量22.93%，闷润时间2.79 h，炒制温度145.0 ℃，综合评分为7.285。
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图 3 醋用量、闷润时间、炒制温度两两交互作用的响应面图Figure 3. Response surface diagram of the interaction between vinegar dosage, smothering and wetting time and frying temperature2.4 工艺验证
为便于实际生产，将工艺参数调整为醋用量23%，闷润时间2.8 h，炒制温度145 ℃。使用此条件平行3次，各指标含量的平均值分别为SSA 0.65%，SSD 0.74%，浸出物20.67%，综合评分为7.128（RSD<1%），与预测值的7.285偏差为2.155%。说明工艺稳定性好，可重复性高。
2.5 柴胡、醋柴胡保肝作用初探
2.5.1 柴胡、醋柴胡对APAP诱导急性肝损伤小鼠ALT、AST的影响
结果如图4。ALT和AST是检测肝损伤的两种标示性转氨酶[31]。肝细胞受到损伤时，大量的ALT、AST酶类物质释放到血液中，不同的ALT、AST水平可以表示肝损伤程度[32]。与C组相比，M组的ALT、AST水平显著上升（P<0.05），由此可知，APAP诱导的肝损伤模型建立成功；VS组、S组、NAC组相较于M组，血清中的ALT、AST都显著下调（P<0.05）；其中VS组与S组相比，VS组的各指标下调更为明显。
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图 4 柴胡、醋柴胡对APAP诱导急性肝损伤小鼠AST、ALT的影响(n=8)Figure 4. Effect of Chai Hu and vinegar Chai Hu on AST and ALT in APAP-induced acute liver injury mice (n=8)![]()
图 5 各组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子水平（n=8）Figure 5. IL-1β, IL-6 and TNF-α serum cytokine levels of mice in different groups (n=8)2.5.2 柴胡、醋柴胡对小鼠血清中炎症因子水平的影响
结果如图5。IL-6、IL-1β、TNF-α是重要的细胞炎症因子，当其水平大幅度上升代表机体出现严重的炎症反应[33]。TNF-α是肝脏中的重要的促炎因子；IL-6是参与机体免疫应答的炎症因子；IL-1β也可预示着炎症的发生，因此三种炎症因子的水平可以表达APAP诱导的急性肝损伤的受损程度[34]。APAP导致IL-6、IL-1β、TNF-α在M组小鼠血清中具有最高表达量（P<0.05）。VS组、S组与M组相比，IL-6、IL-1β、TNF-α表达量显著降低（P<0.05），但略高于NAC组。因此可以看出，柴胡、醋柴胡可以抑制血清中的炎性因子 TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，并且醋柴胡的作用更为显著（P<0.05）。由此可知，醋柴胡、柴胡可以通过调控APAP引起的炎症反应，改善肝损伤。
2.5.3 柴胡、醋柴胡对小鼠肝组织中GSH、GSH-Px和SOD活性及MDA含量的影响
结果如图6。在APAP诱导的小鼠急性肝损伤中，氧化应激也是发生机制之一，大量的氧自由基量生成和氧化应激次数的增多会加重肝损伤过程[35]。MDA是脂质过氧化的最终产物之一，它的水平多少可以直接表达脂质过氧化程度。SOD含量的高低反映了机体抗氧化能力；GSH在APAP诱导小鼠肝损伤的过程中对NAQPI有着解毒的作用，而GSH-Px则可以较好的反映抗氧化能力[36]。与C组相比，M组的MDA显著高于C组（P<0.05），SOD、GSH、GSH-Px显著低于C组（P<0.05）。与M组比较，NAC组和VS组各项指标均具有显著性差异（P<0.05）。S组对GSH和GSH-Px改善不明显。
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图 6 柴胡、醋柴胡对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、GSH、MDA的影响(n=8)Figure 6. Effect of Chai Hu and vinegar Chai Hu on SOD, GSH-Px, GSH and MDA in mouse liver tissues (n=8)2.5.4 H&E染色结果
小鼠肝组织病理图像如图7。C组具有完整的肝小叶结构，肝细胞排列紧密。M组结构发生了改变，细胞肿胀，有炎症因子浸润和细胞出血的情况。NAC组肝细胞形态基本恢复正常，组织结构较完整。S组肝脏的肝小叶出现部分损伤，有一定面积肝坏死。VS组肝脏有小面积损伤，肝细胞边缘较清晰，极大程度地缓解了APAP导致的肝损伤。
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图 7 APAP诱导肝损伤小鼠的肝组织病理图像（400×）Figure 7. Histological images of the liver tissue of mice with APAP induced liver injury（400×）3. 结论
柴胡在醋制过程中经过加热、与米醋中成分反应后活性发生变化，并且米醋的醋用量对柴胡肝保护有一定作用 。SSA、SSD均有一定的保肝作用，有学者从柴胡醋制生物学效应方面发现，柴胡醋制后与生柴胡有显著差异[36]。
本实验采用熵权法结合Box-Behnken响应面设计的方式，优化醋炙柴胡的炮制工艺，得到醋炙柴胡优化的炮制工艺：醋用量23%，闷润时间2.8 h，炒制温度145 ℃，其指标含量分别为SSA 0.65%，SSD 0.74%，浸出物20.67%，综合评分为7.128。并且通过工艺验证得出此工艺稳定、可靠，可以为细化醋柴胡饮片标准提供一些参考。
研究结果表明，醋柴胡对APAP诱导的小鼠急性肝损伤有改善作用。醋柴胡可有效降低肝损伤小鼠血清中的AST、ALT活力水平，下调血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α炎症因子水平，使肝组织中的SOD、GSH、GSH-Px活性显著上升（P<0.05），MDA含量显著下降（P<0.05）。而柴胡饮片对于GSH和GSH-Px水平作用不显著（P>0.05）。由以上可知，醋柴胡对APAP诱导的小鼠急性肝损伤有治疗作用，可能与SSA含量或浸出物中的其他组分增加有关，其机制可能是通过降酶保肝、抗氧化应激、抑制炎症因子的释放等途径抑制急性肝损伤。柴胡醋炙后的其他组分对急性肝损伤的作用有待进一步研究。
综上所述，本研究对比了柴胡醋炙前后对APAP诱导的小鼠急性肝损伤治疗作用，为柴胡、醋柴胡治疗APAP诱导的急性肝损伤补充了理论依据，进一步扩大柴胡、醋柴胡的应用。
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图 1 混合对照品（A）、醋柴胡样品（B）和柴胡样品（C）的色谱图
注：1. SSA 2. SSD。
Figure 1. Chromatograms of mixed reference（A）, vinegar Chai Hu sample（B）and Chai Hu sample（C）
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图 3 醋用量、闷润时间、炒制温度两两交互作用的响应面图
Figure 3. Response surface diagram of the interaction between vinegar dosage, smothering and wetting time and frying temperature
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图 4 柴胡、醋柴胡对APAP诱导急性肝损伤小鼠AST、ALT的影响(n=8)
Figure 4. Effect of Chai Hu and vinegar Chai Hu on AST and ALT in APAP-induced acute liver injury mice (n=8)
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图 5 各组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子水平（n=8）
Figure 5. IL-1β, IL-6 and TNF-α serum cytokine levels of mice in different groups (n=8)
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图 6 柴胡、醋柴胡对小鼠肝组织中SOD、GSH-Px、GSH、MDA的影响(n=8)
Figure 6. Effect of Chai Hu and vinegar Chai Hu on SOD, GSH-Px, GSH and MDA in mouse liver tissues (n=8)
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图 7 APAP诱导肝损伤小鼠的肝组织病理图像（400×）
Figure 7. Histological images of the liver tissue of mice with APAP induced liver injury（400×）
表 1 响应面试验的因素和水平
Table 1 Factors and levels of response surface testing
水平 因素 A 醋用量（%） B 闷润时间（h） C 炒制温度（℃） −1 20 2 130 0 25 3 140 1 30 4 150 
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表 2 Box-Behnken 试验设计与结果
Table 2 Box-Behnken trial design and results
序号 因素 指标含量（±s） 综合评分M(±s) A醋用量 B闷润时间 C炒制温度 SSA（%） SSD（%） 浸出物（%） 1 1 −1 0 0.64±0.05 0.69±0.10 20.86±0.21 7.057±0.18 2 0 1 −1 0.46±0.03 0.52±0.08 20.25±0.17 7.150±0.15 3 0 1 1 0.47±0.04 0.54±0.09 20.28±0.12 7.194±0.12 4 1 0 −1 0.54±0.04 0.60±0.09 20.57±0.19 7.116±0.16 5 0 0 0 0.63±0.06 0.69±0.11 20.73±0.25 7.283±0.21 6 0 0 0 0.53±0.04 0.55±0.08 20.33±0.09 7.267±0.12 7 −1 1 0 0.62±0.07 0.73±0.14 20.83±0.21 7.077±0.26 8 1 1 0 0.57±0.90 0.67±0.12 20.68±0.19 7.150±0.16 9 −1 −1 0 0.58±0.06 0.67±0.12 20.70±0.28 7.243±0.27 10 0 −1 1 0.53±0.07 0.59±0.08 20.39±0.14 7.213±0.21 11 0 −1 −1 0.58±0.11 0.69±0.13 20.73±0.16 7.164±0.22 12 −1 0 1 0.59±0.09 0.70±0.15 20.75±0.19 7.240±0.22 13 1 0 1 0.65±0.13 0.76±0.13 20.85±0.18 7.187±0.19 14 0 0 0 0.65±0.08 0.74±0.09 20.87±0.21 7.267±0.28 15 −1 0 −1 0.67±0.12 0.75±0.11 20.89±0.22 7.230±0.31
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表 3 回归模型方差结果
Table 3 Regression model variance results
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 0.067 9 0.00747 49.22 0.0002 ** A 0.0098 1 0.00982 64.69 0.0005 ** B 0.0014 1 0.00143 9.44 0.0277 * C 0.0038 1 0.00380 25.02 0.0041 ** AB 0.0169 1 0.01686 111.07 0.0001 ** AC 0.0009 1 0.00091 5.97 0.0585 BC 0.00001 1 0.00001 0.050 0.8326 A2 0.0150 1 0.01502 98.98 0.0002 ** B2 0.0219 1 0.02187 144.12 <0.0001 ** C2 0.00085 1 0.00085 5.62 0.0640 残差 0.0007 5 0.00015 失拟项 0.0006 3 0.00019 2.12 0.3366 净误差 0.00018 2 0.00009 总和 0.068 14 R2=0.9888 Radj2=0.9687 注：*表示显著（P<0.05），**表示极显著（P<0.01 ）。
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