Contents of Polyphenols and Flavonoids and Its Antioxidant Activity Evalution in Different Kinds of Mango Kernel Seeds
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摘要: 为给芒果加工副产物综合利用提供理论依据，以芒果核为原料，研究桂七、贵妃、台农、金煌芒、玉芒和象牙芒六个品种中的多酚和黄酮含量及其抗氧化活性的影响。结果显示，玉芒芒果核多酚和黄酮含量最高，分别为4.31和1.07 mg/g，金煌芒、台农、桂七、象牙芒、贵妃芒果核中的多酚含量分别为4.20、4.10、3.96、3.86、3.82 mg/g，其黄酮含量分别为0.95、0.88、0.92、0.96、0.75 mg/g；抗氧化活性研究结果发现，玉芒芒果核羟基自由基（·OH）清除率、超氧阴离子自由基清除率最强，为90.1%和83.9%。通过相关性分析发现，多酚和黄酮含量分别与羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率显著相关（P<0.05），不同品种芒果核中多酚、黄酮含量高低与其抗氧化活性呈正效应的量效关系，且黄酮对芒果核抗氧化能力影响较大，其含量的变化有可能是导致不同品种芒果核抗氧化能力差异的重要因素。Abstract: In order to provide a theoretical basis for comprehensive utilization of mango byproducts, mango (Mangifera India L
) kernel seeds were used as materials, the contents of polyphenol and flavonoid in mango of different varieties (Guiqi, Guifei, Tainong, Jinhuang, Yu and Ivory) mango kernel seeds and the antioxidant activity were studied. The contents of polyphenol and flavonoid in six varieties of mango kernel seeds were abundant. The highest contents of polyphenol and flavonoid in Yu were 4.31 and 1.07 mg/g. The respective polyphenol contents of Jinhuang, Tainong, Guiqi, Ivory, Guifei mango kernel seeds were 4.20, 4.10, 3.96, 3.86 and 3.82 mg/g. The respective flavonoid content of those was 0.95, 0.88, 0.92, 0.96 and 0.75 mg/g. The reasons of the differences of antioxidant activity of mango seeds were analyzed. The results showed that the scavenging rates of hydroxyl radical (·OH) and superoxide anion radical were the highest, which were 90.1% and 83.9%. Through correlation analysis found that the contents of polyphenol and flavonoid in different varieties mango kernel seeds were correlated with hydroxyl radical scavenging rate and superoxide anion radical scavenging rate significantly, respectively(P<0.05), and flavonoid had a greater influence on the antioxidant capacity of mango kernel seeds, and changes of flavonoid content might be an important factor leading to the difference of antioxidant capacity of different varieties of mango seeds. -
芒果（Mangifera indica L.）属于漆树科植物，广泛种植于热带亚热带地区，是我国最具有经济价值的热带水果之一 [1-2]。芒果属于性平味甘、解渴生津的果品，有益胃、止呕、防晕的功效[3]，且芒果中含有的芒果苷具有明显的抗过氧化、保护脑神经元和祛痰止咳的功效[4-5]。据中国药典记载，芒果核是蒙医习用药之一，具有极高的营养价值和药用价值[6-8]。我国芒果种质资源非常丰富、已有超过100个品种[9-10]。中国芒果看广西，芒果是广西除香蕉外最大宗的热带水果，栽培面积和产量位居全国首位，年产值约达5亿元，具有重要的经济和社会价值，但芒果深加工率不足10%，且约占原料30%~60%的废弃物芒果核很少利用[11-12]。芒果核含有大量的天然活性化合物，如没食子酸、芒果苷、香草醛、酚酸、单宁、丁香酸、类黄酮等[13-16]，具有抗炎[17-18]、止咳祛痰[19]、抑菌[20]、抗氧化活性[21-22]、抗糖尿病[23]等功效，具有很高的药用价值。Darwish等[6]研究发现埃及芒果核富含酚类物质、脂肪酸及氨基酸等营养成分；Gómez-Caravaca等[24]采用HPLC-DAD-q-TOF-MS 手段分析发现芒果核中芒果甙、鞣花酸等含量非常高，某些多酚物质含量媲美甚至超过抗氧化之王石榴。
近年来，我国围绕芒果核多酚类物质、黄酮类、吡酮类、萜类等活性成分及其抑菌、抗氧化功能进行的相关研究越来越多。高云涛等[25]采用超声与双水相体系提取芒果核多酚及活性的研究，提取物可有效抑制脂质过氧化和诱导红细胞氧化损伤抑制作用；莫武桂等[26]对芒果核提取物在动物体内外抑菌效果及其安全性进行了研究；本课题组前期也对芒果核活性物质筛选、多酚物质提取及抗氧化性能进行了研究[27-28]，发现芒果核中鞣花酸、芒果苷及一些多酚类物质等含量较高且具有良好的抗氧化活性功能，但不同品种芒果核多酚和含量及抗氧化活性影响还有待分析。因此为明确不同品种芒果核多酚和黄酮含量及抗氧化活性的影响，评价品种对抗氧化活性的影响，本实验以桂七、贵妃、台农、金煌芒、玉芒和象牙芒六个品种的芒果核作为原料，测定其多酚和黄酮含量，同时通过测定芒果核提取物对羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、亚硝酸根离子清除率及DPPH自由基清除率，结合相关性分析比较探讨不同品种的抗氧化活性差异，旨在为我国芒果核的加工利用提供一定的科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
桂七、贵妃、台农1号、金煌芒、玉芒、象牙芒六种品种新鲜成熟的芒果 贺州市批发市场，去皮去肉取核于60 ℃恒温烘干（48 h）并粉碎后，贮于干燥避光处备用；无水碳酸钠、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、福林酚试剂、没食子酸标准品等 广西贺州华嗵试剂有限责任公司。
DFT-50A型高速粉碎机 JIUPIN/久平仪器；DHG-9145A型电热恒温干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；SHZ-82A型数显恒温水浴锅 江苏江苏金怡有限责任公司；BSA124S型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV1901PC型分光光度计 上海奥析科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 提取液的制备
参考本课题组的前期研究结果[27-28]以及预实验结果，芒果核多酚和黄酮物质提取工艺条件为：料液比1:20（g/mL），乙醇体积分数75%，微波功率280 W，微波提取时间90 s。
1.2.2 指标测定方法
1.2.2.1 没食子酸标准曲线的建立
参考本课题组的前期研究[27]，准确称取50 mg没食子酸，用70%乙醇溶液定容至50 mL，即得浓度为1. 0 mg/mL没食子酸标准溶液。取9支50 mL容量瓶，分别移取0、1、2、3、4、5、7.5、10、12.5 mL上述没食子酸标准溶液，将其稀释后配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的标准液。用福林法测定吸光度值。以没食子酸浓度为横坐标，765 nm处的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并进行回归分析[27]。
1.2.2.2 多酚含量的测定
准确移取1.2.1的待测液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加入福林试剂1.0 mL，充分混合后静置2 min，加入10 mL 7%的碳酸钠溶液，充分混合后用蒸馏水定容，置30 ℃恒温水浴中反应1 h，不断振荡。取出，在波长765 nm处测定吸光度值（以蒸馏水为空白对照）。根据标准曲线及其回归方程求出待测液中的多酚含量，然后计算出1 g芒果核样品中多酚类物质的含量（以没食子酸计，mg/g）。
1.2.2.3 黄酮含量的测定
准确称取芦丁标准品粉末20 mg，加入60%乙醇溶解后定容至100 mL摇匀，得到0.2 mg/mL芦丁对照液。分别取芦丁对照液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL放置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀放置6 min，然后加入1 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀放置6 min后加入4%氢氧化钠溶液1 mL，再加入60%的乙醇定容至刻度，摇匀静置15 min后，于500 nm波长下用分分光光度计测定其吸光度值。以芦丁浓度（mg/mL）作为横坐标，吸光度值为纵坐标制作芦丁标准曲线。根据芦丁标准曲线，然后用吸光值计算出提取液中总黄酮浓度，再根据公式计算芒果核总黄酮量。计算公式如下：
总黄酮含量（mg/g）=C×V/W
式中：C为根据标准曲线求得的样品浓度值，单位mg/mL；V为样品液总体积，单位mL；W为原料重量，单位g。
1.2.3 抗氧化活性的测定
1.2.3.1 羟基自由基清除能力
参考本课题组的前期研究[27]，分别取不同质量浓度的芒果核提取物待测样液于5只试管中，各加入硫酸亚铁、双氧水，静置，10 min后加入水杨酸，静置后在510 nm处测定吸光度A1，用蒸馏水替代水杨酸按照上述方法测定吸光度值A2，用蒸馏水代替待测液按上述方法测定吸光度值A0，VC做对照，按照下列公式求提取物对羟自由基的清除率：清除率（%）=[A0−（A1−A2）]/（A0）×100。根据不同浓度与羟基自由基清除率的关系，计算出IC50值。
1.2.3.2 超氧阴离子自由基清除能力
参考本课题组的前期研究[27-28]，取4.5 mL Tris-HCl缓冲溶液，于20 ℃水浴中预热20 min，分别加入1 mL不同浓度的质量浓度的芒果核提取物和0.4 mL 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，于25 ℃水浴中反应5 min，然后加入8 mol/L的HCl溶液1 mL终止反应，在325 nm处测定吸光度A1，空白以蒸馏水代替样品液，测定吸光度A0。样品对超氧阴离子自由基的清除率：清除率（%）=（1−A1/A0）×100。
1.2.3.3 亚硝酸根离子清除能力
取1 mL不同浓度的芒果核提取物溶液于10 mL比色管中，加入5 μg/mL的NaNO2标准溶液0.5 mL，在37 ℃水浴中反应30 min，然后加入0.4%对氨基苯磺酸溶液1 mL，混匀，静置5 min后加0.2%盐酸萘乙二胺溶液0.5 mL，加水至10 mL刻度，混匀，静置15 min，在538 nm处测定吸光度。样品对亚硝酸根离子的清除率：清除率（%）=[（A0−A1/A2）]/ A0×100。其中，A0只加入NaNO2标准溶液的吸光值；A1为加入芒果核提取物后的吸光值；A2为芒果核提取物溶液本底的吸光值。
1.2.3.4 DPPH自由基清除能力
分别取2.0 mL不同质量浓度的芒果核提取物样液于5只试管中，各加入2 mL DPPH（0.04 mg/mL），静置20 min在517 nm检测吸光度A1；以无水乙醇代替DPPH，按照上述方法测定吸光度A2；做空白组按上述方法测定吸光度A0，以VC做对照，样品对DPPH自由基的清除率：清除率（%）=[1−（A1−A2）/A0]×100。根据不同浓度与DPPH·清除率的关系，计算出IC50值。
1.3 数据处理
所有实验均重复3次，数据经Excel 2010初步整理后，采用SPSS22.0进行相关性分析。
2. 结果与分析
2.1 不同品种芒果核提取物多酚和黄酮含量
由图1可知，芒果品种对芒果核多酚和黄酮的含量有明显的影响，图1（a）中表明玉芒芒果核多酚含量高于其他五个品种，为4.31 mg/g；金煌芒、台农次之，分别为4.20和4.10 mg/g，桂七、象牙芒、贵妃较低，分别为3.96、3.86和3.82 mg/g；由图1（b）可知，玉芒芒果核黄酮含量最高，为1.07 mg/g，象牙芒、金煌芒品种芒果核黄酮含量相差不大，为0.96和0.95 mg/g，桂七、台农和贵妃品种的芒果核黄酮含量为0.92、0.88和0.75 mg/g。芒果核多酚含量和黄酮含量因不同品种而产生的差异，有可能是因为芒果品种的产地气候类型差异、生态土壤环境对应性各不同，致使产量和品质上的差异[29]，进而导致多酚、黄酮含量富集不同，但其富集机制仍有待下一步的研究。
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图 1 不同品种芒果核多酚和黄酮含量Figure 1. Effects of different varieties of mango on the polyphenol and flavonoid content of mango seeds2.2 不同品种芒果核提取物对羟基自由基清除能力的影响
比较分析不同品种芒果核提取物对羟基自由基清除能力的影响，结果如图2所示。玉芒果核提取物清除能力最强，达到90.1%，金煌芒次之（87.1%）；桂七和金煌芒的较为接近，为85.7%；象牙芒（84.5%）、台农（83.7%）稍微弱于前两者；而贵妃（82.5%）对羟基自由基清除能力最弱。IC50常用来评价抗氧化剂对自由基的清除能力和抗氧化作用，即清除率达50%时样品的浓度[30-31]，六个品种芒果核提取物的IC50值及其差异显著性如表1所示。IC50值越低则说明抗氧化能力越强，从表1中可以看出各样品IC50值大小，对比IC50值大小说明不同品种芒果核提取物对羟基自由基清除能力的强弱为：玉芒>台农>金煌芒>桂七>贵妃>象牙芒。玉芒与象牙芒之间有显著性差异，说明玉芒芒果核提取物具有较好的抗氧化能力，对比前面多酚黄酮含量分析结果推测，有可能多酚含量的高低决定羟基自由基清除能力强弱，也有可能不同品种及种质资源的差异影响羟基自由基清除能力大小。
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图 2 不同品种芒果核对羟基自由基清除率的影响Figure 2. Effects of different varieties of mango on clearance of hydroxyl radical of mango seeds表 1 六个品种芒果核提取物的IC50及差异显著性Table 1. IC50 value and the significance of six kinds of mango kernel seeds品种 IC50平均值（%） 玉芒 6.33±0.57c 桂七 8.25±0.43b 贵妃 9.36±1.32b 台农 6.82±1.20c 金煌芒 7.61±0.88b 象牙芒 12.68±0.79a 注：a、b、c表示差异显著性，不同字母表示差异显著（P<0.05）。 2.3 不同品种芒果核提取物对超氧阴离子自由基清除能力的影响
比较分析不同品种芒果核提取物对超氧阴离子自由基清除能力的影响，结果如图3所示。玉芒、象牙芒果核提取物清除能力最强，分别为83.9%、83.6%，金煌芒和台农次之，分别为82.2%、81.3%，贵妃对超氧阴离子自由基清除能力最弱。
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图 3 不同品种芒果核对超氧阴离子自由基清除率的影响Figure 3. Effects of different varieties of mango on clearance of super-oxide anion radical free radical of mango seeds2.4 不同品种芒果核提取物对亚硝酸根离子清除能力的影响
比较分析不同品种芒果核提取物对亚硝酸根离子清除能力的影响，结果如图4所示。玉芒、果核提取物清除能力最强为67.1%，金煌芒和象牙芒次之，分别为50.9%和49.6%，台农、贵妃和桂七对亚硝酸根离子清除能力较弱。
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图 4 不同品种芒果核对亚硝酸根离子自由基清除率的影响Figure 4. Effects of different varieties of mango on clearance of nitrite ion free radical of mango seeds2.5 不同品种芒果核提取物对DPPH自由基清除能力的影响
比较分析不同品种芒果核提取物对DPPH自由基清除能力的影响，结果如图5所示。玉芒芒果核提取物清除能力最强为91.2%，金煌芒、桂七和象牙芒次之，分别为88.9%、88.3%和85.3%，台农和贵妃对DPPH自由基离子清除能力较弱。用IC50表示其抗氧化活性强弱，六个品种芒果核提取物的IC50值及其差异显著性如表2所示。对比IC50值大小说明不同品种芒果核提取物对DPPH自由基清除能力的强弱为：玉芒>桂七>金煌芒>象牙芒>贵妃>台农。贵妃和台农无显著性差异，玉芒、桂七、金煌芒与台农之间有显著性差异，且清除DPPH自由基能力的作用分别比贵妃芒高出55%、53%和52%，说明前三种品种芒果核提取物具有较好的抗氧化能力。
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图 5 不同品种芒果核对DPPH自由基清除率的影响Figure 5. Effects of different varieties of mango on clearance of DPPH free radical of mango seeds表 2 六个品种芒果核提取物的IC50及差异显著性Table 2. IC50 value and the significance of six kinds of mango kernel seeds品种 IC50平均值（%） 玉芒 5.99±0.57c 桂七 6.25±0.43c 贵妃 13.27±1.32a 台农 13.33±1.20a 金煌芒 6.32±0.88c 象牙芒 9.35±0.79b 注：a、b、c表示差异显著性，不同字母表示差异显著（P<0.05）。 2.6 抗氧化活性与多酚、黄酮的相关性分析
表3中采用Pearson’s 相关性系数分析了6种不同品种的芒果果核中羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率与多酚、黄酮含量的相关性。结果表明，黄酮含量与羟基自由基清除率（P<0.05）、超氧阴离子自由基清除率（P<0.01）显著相关，相关系数分别为0.893和0.943，多酚含量与羟基自由基清除率显著（P<0.05）相关，相关系数为0.837，与超氧阴离子自由基清除率相关性较低；多酚、黄酮含量与亚硝酸根离子清除率相关性都较低。以上说明黄酮对芒果核抗氧化能力影响较大，其含量的变化有可能是导致不同品种芒果核抗氧化能力差异的重要因素。
表 3 羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率与多酚含量和黄酮含量的相关性分析Table 3. Correlation of coefficients between ·OH clearance,指标 多酚含量 黄酮含量 羟基自由基清除率 超氧阴离子自由基清除率 亚硝酸根离子清除率 DPPH自由基清除率 多酚含量 1.000 0.713 0.837* 0.568 0.638 0.656 黄酮含量 0.713 1.000 0.893* 0.943** 0.784 0.909* 羟基自由基清除率 0.837* 0.893* 1.000 0.719 0.784 0.901* 超氧阴离子自由基清除率 0.568 0.943** 0.719 1.000 0.791 0.773 亚硝酸根离子清除率 0.638 0.784 0.784 0.791 1.000 0.618 DPPH自由基清除率 0.656 0.909* 0.901* 0.773 0.618 1.000 注:“*”表示在0.05水平（双侧）上显著相关；“**”表示在0.01水平（双侧）上极显著相关。 利用SPSS软件进行聚类分析并构建树状图，结果如图6，金煌芒和象牙芒、贵妃和台农聚类显示其相互间可能亲缘关系较近；根据文献[32]芒果种质资源性状评价及亲缘关系分析研究发现显示金煌芒和象牙芒的遗传相似系数差别较小，说明二者遗传背景相似，亲缘关系近；贵妃、台农、桂七聚在一起，有可能芒果品种遗传组分更加相似。
3. 结论
本研究探索了不同品种芒果核多酚、黄酮含量及抗氧化活性差异，研究发现：玉芒芒果核提取物多酚含量（4.31 mg/g）明显高于其他几种类型，黄酮含量（1.07 mg/g）亦有类似趋势；不同抗氧化评价体系和相关性分析结果表明，芒果核抗氧化活性与多酚及黄酮表现出良好的相关性，尤其是黄酮对芒果核抗氧化能力影响较多酚物质更强，其含量的变化有可能是导致不同品种芒果核抗氧化能力差异的重要因素。以上研究结果为芒果品种选育、品种结构优化、加工副产物综合利用提供科学依据。
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图 1 不同品种芒果核多酚和黄酮含量
Figure 1. Effects of different varieties of mango on the polyphenol and flavonoid content of mango seeds
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图 2 不同品种芒果核对羟基自由基清除率的影响
Figure 2. Effects of different varieties of mango on clearance of hydroxyl radical of mango seeds
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图 3 不同品种芒果核对超氧阴离子自由基清除率的影响
Figure 3. Effects of different varieties of mango on clearance of super-oxide anion radical free radical of mango seeds
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图 4 不同品种芒果核对亚硝酸根离子自由基清除率的影响
Figure 4. Effects of different varieties of mango on clearance of nitrite ion free radical of mango seeds
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图 5 不同品种芒果核对DPPH自由基清除率的影响
Figure 5. Effects of different varieties of mango on clearance of DPPH free radical of mango seeds
表 1 六个品种芒果核提取物的IC50及差异显著性
Table 1 IC50 value and the significance of six kinds of mango kernel seeds
品种 IC50平均值（%） 玉芒 6.33±0.57c 桂七 8.25±0.43b 贵妃 9.36±1.32b 台农 6.82±1.20c 金煌芒 7.61±0.88b 象牙芒 12.68±0.79a 注：a、b、c表示差异显著性，不同字母表示差异显著（P<0.05）。 
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表 2 六个品种芒果核提取物的IC50及差异显著性
Table 2 IC50 value and the significance of six kinds of mango kernel seeds
品种 IC50平均值（%） 玉芒 5.99±0.57c 桂七 6.25±0.43c 贵妃 13.27±1.32a 台农 13.33±1.20a 金煌芒 6.32±0.88c 象牙芒 9.35±0.79b 注：a、b、c表示差异显著性，不同字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 3 羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率与多酚含量和黄酮含量的相关性分析
Table 3 Correlation of coefficients between ·OH clearance,
指标 多酚含量 黄酮含量 羟基自由基清除率 超氧阴离子自由基清除率 亚硝酸根离子清除率 DPPH自由基清除率 多酚含量 1.000 0.713 0.837* 0.568 0.638 0.656 黄酮含量 0.713 1.000 0.893* 0.943** 0.784 0.909* 羟基自由基清除率 0.837* 0.893* 1.000 0.719 0.784 0.901* 超氧阴离子自由基清除率 0.568 0.943** 0.719 1.000 0.791 0.773 亚硝酸根离子清除率 0.638 0.784 0.784 0.791 1.000 0.618 DPPH自由基清除率 0.656 0.909* 0.901* 0.773 0.618 1.000 注:“*”表示在0.05水平（双侧）上显著相关；“**”表示在0.01水平（双侧）上极显著相关。
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