Effects of Exogenous Cellulase on the Quality of Black Tea of JiangHua-KuCha
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摘要: 本文以江华苦茶鲜叶为原料，研究了不同纤维素酶浓度对江华苦茶红茶加工品质的影响，实验添加20 mL浓度分别为0.5、1、1.5 g/L的外源纤维素酶进行江华苦茶红茶的加工，经过茶叶感官审评、常规理化分析和茶叶挥发性物质分析等发现，添加20 mL浓度为1.5 g/L的纤维素酶与2.5 kg茶鲜叶发酵生产的红茶品质最佳，红茶中水浸出物总量、游离氨基酸、茶黄素和茶红素等物质含量增加，EGCG、咖啡碱等苦涩物质含量降低，滋味愈发醇厚，茶汤浓度和苦涩度明显降低，红茶口感得到良好改善。同时，外源纤维素酶能够促进红茶挥发性物质种类的增加，推动茶叶香气前体物质向芳香类化合物转化，使得苦茶红茶花香馥郁，高扬悠长，从而改善江华苦茶红茶的品质，以期为江华苦茶资源开发及利用提供借鉴。Abstract: In this paper, the effect of different cellulase concentrations on the processing quality of black tea from Jianghua-Kucha was studied using fresh leaves of Jianghua-Kucha as raw material. 20 mL of exogenous cellulase at concentrations of 0.5, 1 and 1.5 g/L were added for the processing of black tea from Jianghua-Kucha of cellulase with 2.5 kg of fresh tea leaves fermented to produce the best quality black tea, the content of total water extract, free amino acids, theaflavin and theaflavin in black tea increased, the content of bitter and astringent substances such as EGCG and caffeine decreased, the taste became more mellow, the concentration of tea broth and bitterness decreased significantly, and the taste of black tea was well improved. At the same time, exogenous cellulase can promote the increase of black tea volatile substances, promote the transformation of tea aroma precursors to aromatic compounds, make the bitter tea black tea floral aroma fragrant, high and long, thus improving the quality of Jianghua-Kucha black tea, in order to provide reference for the development and utilization of Jianghua-Kucha resources.
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江华苦茶（Camellia sinensis var. assamica cv.Jianghua）是湖南省地方性群体品种，以江华瑶族自治县和蓝山县最多，位置约在北纬24°40’~25°20’，海拔在1000~1500 m之间[1]。江华苦茶茶多酚和儿茶素类物质极其丰富，多酚类总量达39%以上[2]。酚氨比的平均值在15以上，适制红茶，以其原料所制红茶在原产地可达到二套样水平，汤色红浓，香气浓烈，滋味浓强[3]、略带苦涩，是非常好的红茶加工原料。但是在江华地区，江华苦茶多为乔木，采摘难度大，且传统加工的江华苦茶，苦涩味重，外形欠美观，价格低，性价比较低，苦茶资源尚未得到充分利用。
茶叶中含有大量的茶多酚、蛋白质等物质，约占茶叶干物重的20%~25%[4]。纤维素和果胶是茶叶细胞壁的主要组成部分，增加茶叶细胞的坚韧性，保护茶叶细胞不被破坏[5-6]。传统红茶的加工工艺主要是萎凋、揉捻、发酵、干燥，其中发酵是红茶品质形成的关键因素[7]。红茶发酵的本质是茶鲜叶内的酶催化茶多酚等内含物质反应的过程。其中，儿茶素氧化聚合形成的红茶三素是红茶重要的品质因子[8-9]。外源纤维素酶能够破坏茶叶中的细胞壁，使得在揉捻过程茶叶内含物质释放的增加，促进茶多酚、氨基酸和咖啡碱的溶出，增加茶多酚与酶等发生反应的量，促进茶多酚充分转化，同时提高红茶的水浸出物含量、茶黄素含量及香气释放量，从而达到提高茶叶品质的目的[10-11]。
研究发现，在夏季绿茶加工过程中添加木瓜蛋白酶和纤维素酶均能明显提高茶汤中氨基酸和可溶性糖的含量，有效降低了夏秋茶的苦涩味[12]。在传统绿茶加工工艺的揉捻工序中，添加外源单宁酶，能够有效降低酯型儿茶素含量，增加氨基酸含量，在一定程度上降低夏秋茶的苦涩味，提高茶汤的鲜爽度[13]。在茶叶萎凋时添加外源纤维素酶，使细胞壁水解，内源酶与茶叶有效物质充分接触，发酵完全，显著提升了金观音夏季红茶的品质，茶黄素、茶红素的含量分别达到0.57%、0.93%[14]。在红茶发酵时添加多酚氧化酶，所得红茶中的茶黄素，茶红素明显增多，茶汤色泽和香气得到显著改善。刘仲华等[15]在红茶发酵时添加胰蛋白酶可明显提高多酚氧化酶活性，从而提高茶黄素和茶红素含量，减少茶褐素的形成，同时缩短发酵时间，有效提升了茶叶品质。
随着制茶工艺学的发展以及茶叶生物化学研究的不断深入，仅靠改变工艺技术指标等外界环境条件来增强酶活性的方法已不能满足生产的需要，因此通过添加外源酶制剂来增强发酵茶叶中酶活性，加速红茶风味形成的方式受到广泛关注。本研究以江华苦茶鲜叶为原料，通过加入外源纤维素酶参与红茶加工，从感官品质、理化成分、茶叶挥发性物质等方面对茶叶品质进行分析，筛选出最适酶添加量，以期为江华苦茶的加工利用提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
江华苦茶鲜叶 2019年4月9号采摘于湖南省江华瑶族自治县牛牯岭茶厂，鲜叶原料为江华苦茶群体种一芽二叶；纤维素酶（40万U/g） 食品级，江苏成谦生物科技有限公司；茚三酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化亚锡、浓硫酸、蒽酮、福林酚、碳酸钠、蒸馏水、乙醚 均为国产分析纯，湖南汇虹试剂有限公司；甲酰胺、超纯水、甲醇、乙酸 色谱纯，美国TEDIA公司。
722E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司制造；电热鼓风干燥箱 上海市实验仪器总厂；6CR-40型茶叶揉捻机、五斗烘干机、6CHT—70型旋转式烘焙提香机 浙江春江茶叶机械有限公司；LC-20高效液相色谱仪（配有紫外检测器）、GCMS-QP2010 SE气相色谱-质谱联用仪（GC-MS） 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 江华苦茶红茶加工工艺流程
萎凋：准确称取茶鲜叶20 kg，将茶鲜叶在室温下摊放(室内温度为28~33 ℃，空气相对湿度75%~85%)进行萎凋，萎凋时间10 h，萎凋至青草气消失即可，并将茶叶均匀分为四组待用。
添加外源酶：萎凋完成后，将纤维素酶溶于25 ℃温水配置成浓度分别为0.5、1、1.5 g/L的纤维素酶液，将20 mL不同浓度的酶均匀喷洒于茶叶上并标记为S1、S2、S3组，同时设置CK组喷洒等量25 ℃清水作为对照，混匀后立即转入弱太阳光下轻晒，促使喷洒的水分尽快散失。
揉捻：萎凋叶表面水分基本散发，将实验组与对照组的萎凋叶分别转入6CR-40型茶叶揉捻机进行揉捻。揉捻时先空揉15 min，加轻压揉捻20 min（揉捻机盖刚好接触茶叶），重压揉捻40 min（中间换两次轻压解块），最后轻压揉捻15 min，整个揉捻过程在一个半小时左右。揉捻之后下机解块。
发酵：将揉捻叶分别转入箩筐中，盖上浸湿后不透光的湿布，使其自然发酵，发酵过程中发酵叶堆内温度23 ℃，室外温度30 ℃，发酵过程不断用喷壶对茶堆喷水，保证发酵堆周围的湿度在80%以上，发酵5.5 h后发酵完成。
干燥：发酵完成后上6CR-40型茶叶揉捻机进行轻压复揉15 h，下机解块后转移至五斗烘干机，用110 ℃烘至水分6%以下，下机用风扇扇凉至室温后再上五斗烘干机用90 ℃烘干至8成干，摊凉后转移至6CHT-70型旋转式烘焙提香机中，在75 ℃下烘至足干。干燥完成后，真空密封−20 ℃保存备用。
1.2.2 试验样品指标的测定方法
1.2.2.1 感官审评
由5名专业人员参照GB/T 23776-2018[16]中红茶的感观审评方法进行打分，审评茶样的外形、汤色、香气、滋味、叶底五项因子，采用加权评分法评分。
总分=外形×20%+汤色×15%+香气×25%+滋味×30%+叶底×10%
1.2.2.2 主要成分测定方法
水分测定（干物率）：GB/T 8304-2013 茶水分测定[17]；水浸出率测定：GB/T 8305-2013 茶水浸出率测定[18]；茶多酚、儿茶素总量测定：GB/T 8313-2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[19]；游离氨基酸总量测定：GB/T 8314-2013 茶游离氨基酸总量的测定[20]。
1.2.2.3 红茶三素的测定
红茶三素的测定采用分离比色法[21]。
供试液制备：准确称取9.00 g茶样置于500 mL锥形瓶中，加入沸水375 mL，摇匀后在沸水浴中浸提10 min，取出摇匀，趁热过滤，待茶汤冷至室温后萃取备用。
准确吸取萃取后的水层萃取液2 mL，放人25 mL容量瓶中，加入2 mL饱和草酸溶液和6 mL水，乙醇定容至刻度（溶液记为A）；准确吸取萃取后的乙酸乙酯层萃取液2 mL放在25 mL的容量瓶中，加入95%乙醇稀释至刻度（溶液记为B）；准确吸取萃取后的乙酸乙酯层萃取液25 mL放入100 mL分液漏斗中，加入2.5%NaHCO3水溶液25 mL，迅速强烈振荡30 s，分层后，弃去NaHCO3层。吸取乙酸乙酯上层液4 mL，放入25 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度（溶液记为C)；最后，用移液管分别吸取25 mL茶汤和25 mL正丁醇放入100 mL分液漏斗中，摇振3 min，待分层后将水层（下层）放于50 mL三角瓶中，取水层液2 mL加饱和草酸2 mL，加入6 mL蒸馏水，加95%乙醇，定容至25 mL(溶液记为D)。
比色测定：用分光光度计在380 mm波长下，用1cm厚的比色杯，以95%乙醇作空白对照，分别测定溶液A、B、C、D的吸光度。并通过下列公式计算红茶三素的含量。
茶黄素(%)=EC×2.25样品干物率 茶红素(%)=7.06×(2EA+2EB−EC−2ED)样品干物率 茶褐素(%)=2ED×7.06样品干物率 1.2.2.4 挥发性成分检测
蒸馏萃取法（simultaneous distillation and extraction，SDE）法[22]：称5 g茶样，加入1 L圆底烧瓶中，再加入500 mL蒸馏水，电热套加热至微沸。另一边在圆底烧瓶中加入50 mL无水乙醚，水浴50 ℃，回流萃取45 min。萃取结束后，放置冰箱冷冻24 h，脱水后，转移至氮吹瓶中，氮吹浓缩至1 mL，移入液相小瓶中密封，放于−20 ℃冰箱保存，等待进样。
GC-MS色谱条件：色谱柱：DB-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。进样口温度：270 ℃。升温程序：初始柱温60 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速度升至93 ℃，保持2 min；以4 ℃/min的速度升至200 ℃，保持2 min；以1 ℃/min的速度升至204 ℃，保持2 min；以8 ℃/min 的速度升至270 ℃，保持7 min。总时间为76 min。载气：氦气，纯度≥99.999%；流速1 mL/min，分流比3:1。
质谱条件：电离方式：电子电离源；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；扫描范围：40~600 u；溶剂延迟：3 min。质量扫描范围m/z40~600。
定性与定量分析方法：根据气相色谱/质谱联用（GC-MS）分析得到挥发性成分的总离子色谱图，通过计算机检索，参考谱库检索（NIST17和NIST14谱库），同时结合保留时间，并用峰面积归一化法分析挥发性物质相对含量。
1.3 数据分析
实验均进行3次重复试验，数据采用Excel软件进行数据统计，Prism8.0.3进行方差分析、差异性分析及图形绘制。
2. 结果与分析
2.1 外源纤维素酶添加量对红茶感官品质的影响
不同处理的江华苦茶红茶感官审评结果如表1所示。纤维素酶处理的三个样品S1、S2、S3感官审评得分均高于CK，其中S3样品评分最高。对照表1中的审评术语及图1能够发现：与传统江华苦茶红茶相比，纤维素酶处理后的红茶干茶色泽乌黑，条索紧实，茶汤红亮，花香馥郁，滋味醇厚苦涩味降低，叶底匀齐柔软。特别是样品S3的外形、香气、滋味均优于其他三个红茶。从外形上看，CK、S1、S2、S3号茶样相差不大，即纤维素酶处理对干茶外形影响不大。但是在香气上，S3号茶样香气馥郁，香气评分比其他三个茶样高2~6分，表明浓度为1.5 g/L的纤维素酶有利于促进茶鲜叶中重要的呈香物质形成，促进了花果香的形成。但茶叶汤色与有无外源纤维素酶添加并未呈现相关性，说明外源纤维素酶对茶样汤色呈色物质影响不大。在江华苦茶红茶加工过程中添加纤维素酶能够改善江华苦茶感官品质。外源纤维素酶接触到茶鲜叶后，水解了细胞壁中的纤维素、果胶等保护物质，茶叶中的酶与茶叶内含物充分接触，发生酶促氧化反应，有效促进江华苦茶苦涩物质的分解，呈味物质的生成，从而促进苦茶红茶感官品质的提升。这与罗晶晶等[12]的研究一致，外源酶的加入能够降低茶汤苦涩度，改善茶汤口感。
表 1 不同处理的红茶感官审评分析Table 1. Sensory review analysis of black tea with different treatments组别 外形
（20%）香气
（25%）汤色
（15%）滋味
（30%）叶底
（10%）总分 CK 条索紧结微曲略扁，显锋苗，较匀齐，
带金毫，色乌欠润（86）甜香（90） 红尚亮（80） 浓厚，刺激性强，较苦涩（79） 偏青（86） 85 S1 条索欠紧结，多扁条，夹片，带金毫，
色乌棕欠润（86）甜香，稍闷（88） 红亮（90） 浓厚，刺激性强,苦涩（83） 尚匀软，较红亮（90） 86.8 S2 条索紧结微曲略扁，显锋苗，带金毫较匀齐，色泽乌黑油润乌润（90） 花香（92） 红亮（94） 浓厚，刺激性强,生青苦涩（80） 偏青（86） 87.7 S3 条索紧结微曲略扁，显锋苗，较匀齐，
带金毫，色泽乌润（92）花香高长（94） 红亮（93） 醇厚（84） 偏青（86） 90.1 ![]()
图 1 不同处理的红茶干茶、汤色和叶底对比Figure 1. Comparison of different treatments of black tea dry tea, soup color and leaf base2.2 外源纤维素酶添加量对江华苦茶红茶理化成分的影响
2.2.1 水浸出物含量分析
水浸出物是规定条件下，用沸水萃取的可溶性物质。茶叶水浸出物中主要组成及其含量的综合协调，决定着茶叶品质。如图2所示，对照组比实验组的水浸出率平均低4.47%，其中CK与S1、S3的水浸出率相差5.92%与6.04%，与S2的水浸出率相差1.46%。经方差分析，在P<0.05的情况下，CK与S1、S3相比差异显著。在红茶加工中添加外源纤维素酶能够促进内含物质释放，提高江华苦茶红茶的水浸出率，使茶叶内含成分溶解到茶汤中，增加茶汤的物质感，茶汤更加醇厚。
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图 2 不同处理红茶水浸出率对比注：图中不同字母表示差异性显著，P<0.05。Figure 2. Comparison of water extracts of black tea with different treatments2.2.2 游离氨基酸与茶多酚总量分析
茶叶中的氨基酸和茶多酚的含量是决定茶叶品质好坏的关键因素，氨基酸含量决定茶汤滋味的鲜爽度，茶多酚的含量决定茶汤的浓度[23-25]。CK与S1、S2、S3茶叶游离氨基酸总量和茶多酚总量对比分析如表2。结果显示，使用外源纤维素酶能够使茶叶中游离氨基酸含量增加，茶多酚含量降低。其中CK游离氨基酸含量与S1相比差异不显著（P>0.05），与S2、S3之间差异显著（P<0.05）。可能是因为1.5 g/L的外源纤维素酶可以破坏茶叶细胞壁，使得茶鲜叶中的蛋白酶与大分子蛋白物质接触更加充分，反应底物的浓度增加，从而使大分子蛋白质逐步降解为小分子的游离氨基酸，使茶叶中氨基酸含量有所提高。酶处理后茶叶中茶多酚含量降低，与感官审评中对照组滋味比实验组更苦涩的结果一致。这与罗晶晶等[14]的研究结果一致。因此，苦茶红茶中茶多酚含量的降低与游离氨基酸含量的升高，使茶叶的酚氨比下降，茶汤滋味向醇和、鲜爽的方向转化，从而改善茶汤滋味，提高江华苦茶的红茶品质。
表 2 不同处理红茶游离氨基酸与茶多酚总量对比Table 2. Comparison of total freeamino acids and tea polyphenols in different black tea treatments样品 游离氨基酸总量（%） 茶多酚总量（%） 酚氨比 CK 2.90±0.37b 12.17±0.07a 4.20 S1 3.12±0.13b 10.16±0.002c 3.26 S2 4.50±0.34a 10.56±0.02b 2.35 S3 4.40±0.16a 9.92±0.005d 2.25 注：表中同一列不同字母表示经LSD法进行多重比较在P<0.05水平上差异显著。 表 3 4种不同处理红茶挥发性成分Table 3. Volatile components of black tea with 4 different treatments编号 保留时间
（min）名称 CK相对含量
（%）S1相对含量
（%）S2相对含量
（%）S3相对含量
（%）1 10.358 2-乙基呋喃 0.22 0.29 0.5 0.21 2 11.457 3-甲基-丁醛 1.39 − − − 3 12.9 戊醛 0.11 − 0.13 0.25 4 13.874 1-戊烯-3-酮 0.12 0.44 0.2 0.13 5 15.577 1-五烯-3-醇 0.35 0.64 0.32 0.66 6 16.111 己醛 2.29 2.63 2.78 2.96 7 17.319 3-己烯醛 0.23 0.6 0.26 0.29 8 17.993 2-正戊基呋喃 0.33 0.32 0.38 0.46 9 18.285 （Z）-3-己烯醛 0.23 − 0.33 − 10 18.519 β-罗西烯 − − 0.15 − 11 19.002 正戊醇 0.37 0.22 0.09 0.06 12 19.945 己酸乙酯 3.54 2.28 2 1.99 13 22.067 (Z)-2-戊烯醇 0.46 − 0.25 0.36 14 22.324 反式-2-己烯醛 − 0.3 − − 15 22.723 2-己烯醛 3.88 4.79 4.62 4.68 16 23.141 正己醇 − 0.22 − − 17 24.768 (Z)-3-己烯-1-醇 1.03 0.59 0.48 1 18 25.068 反式-2-己烯醇 − − − 0.3 19 26.581 甲基庚烯酮 − 0.14 − − 20 26.825 环己基甲基硅烷 − 0.36 − 21 28.081 壬醛 0.99 1.51 1.05 1.05 22 30.471 氧化芳樟醇Ⅱ（反式呋喃） 6.9 3.43 2.47 6.68 23 30.692 （E，E）-2,4-己二醛 0.24 0.29 0.21 7.89 24 31.111 芳樟醇 13.4 6.09 5.54 7.89 25 31.913 糠醛 0.52 0.71 0.85 0.59 26 32.308 十三烷 − − 0.07 − 27 33.786 3-乙基-1,4-己二烯 − 0.13 − − 28 33.94 2-乙酰基呋喃 0.24 − − − 29 34.616 2,4-庚二烯醛 0.29 0.45 0.3 0.14 30 34.967 苯甲醛 0.34 0.86 − 0.77 31 35.06 二氢芳樟醇 0.89 1.14 1.93 1.52 32 35.55 (E)-2-壬烯醛 − − − 0.3 33 35.939 炔环己醇 − 0.21 − − 34 36.399 己酸-4-己烯酯 0.79 − 0.36 0.61 35 36.409 己酸-(Z)-3-己烯醇酯 0.79 − − − 36 38.972 α,α-4-三甲基-3-环己烯-1-甲醇 1.4 0.9 0.97 0.95 37 39.256 2,6-二甲基环己醇 − 0.33 − − 38 39.812 茶吡咯 1.01 0.93 0.86 1.05 39 41.102 3-羟基-(3r,6s)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢吡喃 1.57 2.21 2.57 − 40 41.398 香茅醇 − − 0.5 − 41 41.93 苯乙醛 4.56 14.37 9.49 8.98 42 42.735 （Z）-2,6-辛二烯醛-3,7-二甲基− 0.22 0.33 0.23 − 43 43.04 橙花醇 28.7 24.04 22.37 24.32 44 43.375 水杨酸甲酯 3.77 2.72 2.84 4.51 45 44.349 （E）-丁酸-3,7-二甲基-2,6-辛二烯基酯 0.24 − 0.98 − 46 44.352 异丁酸香叶酯 − − − 0.68 47 44.429 (E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇 0.24 0.31 − − 48 44.749 2-呋喃酮− − − 0.12 − 49 45.507 2,6-二叔丁基对甲酚 − 0.76 − − 50 45.267 十四烷 − − − 0.17 51 45.489 （E）-1-2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基-2-丁烯-1-酮 − − − 0.3 52 46.539 2,4-癸二烯醛 0.4 − 0.25 0.13 53 46.551 2,4-癸二烯醛 − 0.3 − − 54 46.81 十四酸甲酯 0.12 − 0.23 0.2 55 47.05 2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯 − − 0.16 − 56 47.175 苯甲基丁酸酯 − − 0.16 − 57 47.183 N-（3-碘丙基）氨基甲酸苄酯 − − − 0.22 58 47.755 二十四烷 0.21 − − − 59 47.924 (E)-橙花叔醇 1.68 1.43 2.38 2.38 60 48.133 紫罗兰酮 0.41 0.31 0.24 61 48.944 苯乙醇 0.69 1.84 2.69 0.24 62 49.401 （Z）-己酸-3,7-二甲基-2,6-辛二烯基酯 − − 0.53 − 63 49.405 己酸，3,7-二甲基-2,6-辛二烯-己酸基酯 − − − 0.38 64 50.083 (反式)β-紫罗酮 0.8 1.92 1.32 1.12 65 51.153 2,2,8,8-四甲基3,6-壬二烯-5-酮 − − 0.2 − 66 51.381 (Z)-3-甲基-2-(2-戊烯基)-2-环戊烯酮 1.02 0.56 1.64 1.79 67 51.49 蜂蜡酸甲酯 − − 2.06 − 68 51.502 二十一烷酸甲酯 − 0.92 − − 69 51.949 正二十一烷 0.34 1.6 0.39 0.12 70 52.039 E-环氧法呢烯 0.19 − 0.36 − 71 52.044 （E，E）-2,6,10-三甲基-2,6,9,11-十二四烯醇 − − − 0.51 72 52.407 异植醇 0.12 0.21 0.4 − 73 52.607 α-肟基-苯丙酸 − − − 0.38 74 52.819 雪松醇 0.59 0.27 0.63 0.73 75 53.029 顺式-3-己烯醇苯甲酸酯 − − 0.24 0.33 76 53.04 苯甲酸3-己烯-1-醇酯 − 0.25 -− − 77 53.474 辛酸香叶酯 − − 0.05 − 78 54.272 2-正辛基呋喃 − − 0.22 0.17 79 54.626 己酸苯乙酯 − − − 0.14 80 54.894 4-(2,2,6-三甲基-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基)-3-丁烯-2-酮 − 0.36 0.31 0.45 81 55.62 二十六烷 − 0.65 0.28 − 82 55.594 1-碘三十二烷 − − − 0.25 83 56.705 顺式十八碳-9-烯酸 − − 0.32 − 84 56.695 9-十八烯酸甲酯 − − − 0.64 85 57.096 R,R,R,(E)3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-醇乙酸酯 − − 0.17 − 86 57.362 （Z）-3,7-二甲基八-2,6-二烯-1-十二酸酯 − − 0.13 − 87 57.518 二十五烷 3.73 3.91 2.27 1.12 88 58.566 11,14-二十碳二烯酸甲酯 0.66 0.84 0.92 0.68 89 59.411 戊曲酯 − − 0.22 − 90 60.117 植醇 5.23 − 10.13 4.54 91 60.139 植酮 − 6.61 − − 92 60.961 亚麻酸乙酯 0.38 0.27 0.49 0.3 93 61.676 二十八烷 0.61 0.65 1.51 0.23 94 64.143 3-氧代-2-(2-戊烯基)-环戊乙酸甲酯 − − 0.39 0.23 95 65.869 四十四烷 − 0.54 − − 96 66.574 吲哚 0.36 − 0.68 0.3 97 66.967 四氢-6-(2-戊烯基)-2H-2-吡喃酮 − − − 0.23 98 67.105 邻苯二甲酸二异丁酯 0.44 0.22 0.4 0.4 99 67.867 2-甲基二十八(碳)烷 − 0.25 − − 100 69.896 N-（三氟乙酰基）-花生四烯酰胺 − − − 0.15 101 69.151 2,2'-亚甲基双[6-（1,1-二甲基乙基）]-4-甲基苯酚 − 0.64 − − 102 69.96 甲基二十四(碳)烷 − 0.21 − − 103 71.635 邻苯二甲酸二丁酯 0.45 − 0.24 − 104 71.646 1,2-苯二甲酸丁基2-甲基丙酯 -− 0.12 − − 105 72.409 二氢猕猴桃内酯 − − 0.13 − 106 73.301 二十甲基环十硅氧烷 − − 0.56 − 注：−为未检出物质。 2.2.3 儿茶素组分与咖啡碱含量分析
咖啡碱和儿茶素是茶叶中的主要滋味元素与功能成分之一，在滋味方面体现出刺激性与收敛性，功能成分方面，咖啡碱主要体现在兴奋神经，提神醒脑[26]，儿茶素具有抗氧化、抗癌等生物活性[27]。对茶叶品质特征有着重要意义。从图3中发现，实验组与CK相比，咖啡碱与儿茶素均有所降低。相较于CK茶样S3中CAF、EGC、DL-C、EC、EGCG、GCG、ECG分别降低了0.81%、0.63%、0.15%、1.80%、0.33%、0.01%、1%。这与外源纤维素酶的辅助发酵作用有关。茶叶中咖啡碱和儿茶素等氧化聚合产生新的物质导致其含量下降，也印证了审评结果中实验组滋味、苦涩味、鲜爽度弱于对照组的结果。因此，在苦茶红茶加工过程添加外源纤维素酶，有利于促进茶叶中儿茶素、咖啡碱等苦涩物质转化，口感逐渐醇和，改善红茶品质。
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图 3 不同处理红茶儿茶素含量Figure 3. Contents of polyphenols and caffeine in black tea of different treatments2.2.4 红茶三素分析
如图4所示，4个样品中S3茶黄素含量最高为0.832%，CK茶黄素含量最低为0.383%。CK茶红素含量最低为6.296%，S1茶红素含量最高为7.514%。纤维素酶处理后，苦茶红茶中茶黄素、茶黄素含量增加，纤维素酶对茶黄素、茶红素的形成具有促进作用。CK中茶褐素含量最高，纤维素酶处理后，茶褐素含量降低。在红茶加工过程中，加入浓度为1.5 g/L的纤维素酶促进茶黄素、茶红素含量增加，茶褐素含量降低，红茶三素比例改变，茶叶汤色变红变亮，滋味更加醇厚。与林剑锋等[9]的研究相比，本研究纤维素酶对茶黄素含量并没有显著促进作用。
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图 4 不同处理红茶茶黄素、茶红素、茶褐素含量分析注：图中不同字母表示差异性显著，P<0.05。Figure 4. Content analysis of theaflavin, thearubicin and theabrownin in black tea with different treatments2.3 红茶挥发性成分分析
茶叶加工过程中产生的多种挥发性物质，是决定茶叶风味品质、产品等级和品质优劣的一个重要指标[28]。通过SDE-GC-MS定性分析，鉴定出江华苦茶红茶茶样CK、S1、S2、S3中分别有54种、57种、70种、59种挥发性香气物质，总香气种类为106种（样品GC-MS谱图如图5）。这些香气化合物包括醇类（26）、醛类（16）、酮类（11）、酯类（29）、酸类（2）、烃类（15）和其他类（7）化合物。其中，醇类，醛类和酯类的化合物多于其他几组。如表3所示，较对照组中的S1、S2、S3而言，CK组中3-甲基-丁醛，2-乙酰基呋喃、己酸-(Z)-3-己烯醇酯等香气物质表现出特异性存在。除此之外，S1、S2、S3组之间，随着外源纤维素酶的浓度变化，其香气物质的含量和比例也略有不同，如随着酶浓度的升高，S组中2-己烯醛、戊醛等香气成分的表达量随之升高。不仅如此，一些挥发性的香气物质，在加入外源酶之后，在CK组中并未检测到，但是在S组中却有较高的表达量，包括异丁酸香叶酯、（Z）-己酸-3,7-二甲基-2,6-辛二烯基酯等，且大多为酯类化合物。将排名前十的化合物进行大类划分后，CK中前10的化合物为橙花醇、芳樟醇、叶绿醇、氧化芳樟醇Ⅱ（反式呋喃）、水杨酸甲酯、苯乙醛、二十八烷、2-己烯醛、正二十一烷；而S1中前10的化合物为橙花醇、苯乙醛、植酮、芳樟醇、2-己烯醛、二十五烷、氧化芳樟醇Ⅱ（反式呋喃）、水杨酸甲酯、己醛、3-羟基-(3r,6s)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢吡喃；S2中前10的化合物为橙花醇、植醇、苯乙醛、芳樟醇、2-己烯醛、水杨酸甲酯、己醛、苯乙醇、3-羟基-(3r,6s)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢吡喃、氧化芳樟醇Ⅱ（反式呋喃）；S3中前10的化合物为橙花醇、苯乙醛、芳樟醇、氧化芳樟醇Ⅱ（反式呋喃）、2-己烯醛、植醇、水杨酸甲酯、己醛、苯乙醇、(E)-橙花叔醇。由此可见，S组中的香气成分较对照组具有更加丰富的香气成分，香气成分的构造也较CK组更复杂。其中橙花醇，苯乙醛等化合物是江华苦茶红茶主要的香气物质。相关研究发现，橙花醇带有玫瑰和橙花的香气、苯乙醛具有强烈风信子香气、雪松醇温和的杉木芳香、呋喃型氧化芳樟醇具有紫丁香、铃兰与玫瑰的花香，己醛青草气及苹果香味[29]。因此，以江华苦茶为原料加工的红茶具有花香、香气高扬。
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图 5 不同处理红茶香气成分GC-MS谱图Figure 5. GC-MS spectrum of main aroma of black tea with different technology茶叶中的香气化合物部分来自鲜叶，部分来自加工[30]。如表3所示CK中的主要化合物是芳樟醇、叶绿醇等香气化合物是茶鲜叶中原有的香气化合物。而由芳樟醇、叶绿醇转化而来的芳樟醇氧化物、苯乙醛等游离态的香气化合物含量较低。S1、S2、S3中芳樟醇等茶鲜叶原有的香气物质含量低，芳樟醇氧化物、苯乙醛、水杨酸甲酯等香气物质含量高。在江华苦茶红茶加工过程中加入外源纤维素酶，所得红茶香气物质种类增加并且主要呈香物质也由具有青草气的叶绿醇等化合物转化为具有花香气味的氧化芳樟醇等化合物，使得茶叶花香馥郁。这是由于添加的外源纤维素酶使细胞壁溶解，茶鲜叶中的化合物接触更加充分，各类化合物间发生的反应更多，产生的香气化合物也更多，香气更加高扬。因此，添加外源纤维素酶促进江华苦茶红茶香气化合物产生，推动花香类化合物的转化，从而提高茶叶香气，改善江华苦茶红茶品质。
3. 结论
通过对江华苦茶红茶感官审评、常规理化分析及挥发性物质等综合分析发现，在江华苦茶红茶加工过程中2.5 kg鲜叶添加20 mL浓度为1.5 g/L的外源纤维素酶，能够促进茶多酚、咖啡碱等苦涩物质转化，提高游离氨基酸、水浸出物和红茶三素等物质的含量，促进花香类化合物形成，从而降低江华苦茶红茶苦涩味，增加鲜爽度、改善茶汤滋味，茶叶香气变得馥郁高扬。因此，添加外源纤维素酶对提高江华苦茶红茶的品质具有重要的指导作用，值得进一步探究。
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图 1 不同处理的红茶干茶、汤色和叶底对比
Figure 1. Comparison of different treatments of black tea dry tea, soup color and leaf base
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图 2 不同处理红茶水浸出率对比
注：图中不同字母表示差异性显著，P<0.05。
Figure 2. Comparison of water extracts of black tea with different treatments
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图 3 不同处理红茶儿茶素含量
Figure 3. Contents of polyphenols and caffeine in black tea of different treatments
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图 4 不同处理红茶茶黄素、茶红素、茶褐素含量分析
注：图中不同字母表示差异性显著，P<0.05。
Figure 4. Content analysis of theaflavin, thearubicin and theabrownin in black tea with different treatments
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图 5 不同处理红茶香气成分GC-MS谱图
Figure 5. GC-MS spectrum of main aroma of black tea with different technology
表 1 不同处理的红茶感官审评分析
Table 1 Sensory review analysis of black tea with different treatments
组别 外形
（20%）香气
（25%）汤色
（15%）滋味
（30%）叶底
（10%）总分 CK 条索紧结微曲略扁，显锋苗，较匀齐，
带金毫，色乌欠润（86）甜香（90） 红尚亮（80） 浓厚，刺激性强，较苦涩（79） 偏青（86） 85 S1 条索欠紧结，多扁条，夹片，带金毫，
色乌棕欠润（86）甜香，稍闷（88） 红亮（90） 浓厚，刺激性强,苦涩（83） 尚匀软，较红亮（90） 86.8 S2 条索紧结微曲略扁，显锋苗，带金毫较匀齐，色泽乌黑油润乌润（90） 花香（92） 红亮（94） 浓厚，刺激性强,生青苦涩（80） 偏青（86） 87.7 S3 条索紧结微曲略扁，显锋苗，较匀齐，
带金毫，色泽乌润（92）花香高长（94） 红亮（93） 醇厚（84） 偏青（86） 90.1 
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表 2 不同处理红茶游离氨基酸与茶多酚总量对比
Table 2 Comparison of total freeamino acids and tea polyphenols in different black tea treatments
样品 游离氨基酸总量（%） 茶多酚总量（%） 酚氨比 CK 2.90±0.37b 12.17±0.07a 4.20 S1 3.12±0.13b 10.16±0.002c 3.26 S2 4.50±0.34a 10.56±0.02b 2.35 S3 4.40±0.16a 9.92±0.005d 2.25 注：表中同一列不同字母表示经LSD法进行多重比较在P<0.05水平上差异显著。
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表 3 4种不同处理红茶挥发性成分
Table 3 Volatile components of black tea with 4 different treatments
编号 保留时间
（min）名称 CK相对含量
（%）S1相对含量
（%）S2相对含量
（%）S3相对含量
（%）1 10.358 2-乙基呋喃 0.22 0.29 0.5 0.21 2 11.457 3-甲基-丁醛 1.39 − − − 3 12.9 戊醛 0.11 − 0.13 0.25 4 13.874 1-戊烯-3-酮 0.12 0.44 0.2 0.13 5 15.577 1-五烯-3-醇 0.35 0.64 0.32 0.66 6 16.111 己醛 2.29 2.63 2.78 2.96 7 17.319 3-己烯醛 0.23 0.6 0.26 0.29 8 17.993 2-正戊基呋喃 0.33 0.32 0.38 0.46 9 18.285 （Z）-3-己烯醛 0.23 − 0.33 − 10 18.519 β-罗西烯 − − 0.15 − 11 19.002 正戊醇 0.37 0.22 0.09 0.06 12 19.945 己酸乙酯 3.54 2.28 2 1.99 13 22.067 (Z)-2-戊烯醇 0.46 − 0.25 0.36 14 22.324 反式-2-己烯醛 − 0.3 − − 15 22.723 2-己烯醛 3.88 4.79 4.62 4.68 16 23.141 正己醇 − 0.22 − − 17 24.768 (Z)-3-己烯-1-醇 1.03 0.59 0.48 1 18 25.068 反式-2-己烯醇 − − − 0.3 19 26.581 甲基庚烯酮 − 0.14 − − 20 26.825 环己基甲基硅烷 − 0.36 − 21 28.081 壬醛 0.99 1.51 1.05 1.05 22 30.471 氧化芳樟醇Ⅱ（反式呋喃） 6.9 3.43 2.47 6.68 23 30.692 （E，E）-2,4-己二醛 0.24 0.29 0.21 7.89 24 31.111 芳樟醇 13.4 6.09 5.54 7.89 25 31.913 糠醛 0.52 0.71 0.85 0.59 26 32.308 十三烷 − − 0.07 − 27 33.786 3-乙基-1,4-己二烯 − 0.13 − − 28 33.94 2-乙酰基呋喃 0.24 − − − 29 34.616 2,4-庚二烯醛 0.29 0.45 0.3 0.14 30 34.967 苯甲醛 0.34 0.86 − 0.77 31 35.06 二氢芳樟醇 0.89 1.14 1.93 1.52 32 35.55 (E)-2-壬烯醛 − − − 0.3 33 35.939 炔环己醇 − 0.21 − − 34 36.399 己酸-4-己烯酯 0.79 − 0.36 0.61 35 36.409 己酸-(Z)-3-己烯醇酯 0.79 − − − 36 38.972 α,α-4-三甲基-3-环己烯-1-甲醇 1.4 0.9 0.97 0.95 37 39.256 2,6-二甲基环己醇 − 0.33 − − 38 39.812 茶吡咯 1.01 0.93 0.86 1.05 39 41.102 3-羟基-(3r,6s)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢吡喃 1.57 2.21 2.57 − 40 41.398 香茅醇 − − 0.5 − 41 41.93 苯乙醛 4.56 14.37 9.49 8.98 42 42.735 （Z）-2,6-辛二烯醛-3,7-二甲基− 0.22 0.33 0.23 − 43 43.04 橙花醇 28.7 24.04 22.37 24.32 44 43.375 水杨酸甲酯 3.77 2.72 2.84 4.51 45 44.349 （E）-丁酸-3,7-二甲基-2,6-辛二烯基酯 0.24 − 0.98 − 46 44.352 异丁酸香叶酯 − − − 0.68 47 44.429 (E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇 0.24 0.31 − − 48 44.749 2-呋喃酮− − − 0.12 − 49 45.507 2,6-二叔丁基对甲酚 − 0.76 − − 50 45.267 十四烷 − − − 0.17 51 45.489 （E）-1-2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基-2-丁烯-1-酮 − − − 0.3 52 46.539 2,4-癸二烯醛 0.4 − 0.25 0.13 53 46.551 2,4-癸二烯醛 − 0.3 − − 54 46.81 十四酸甲酯 0.12 − 0.23 0.2 55 47.05 2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯 − − 0.16 − 56 47.175 苯甲基丁酸酯 − − 0.16 − 57 47.183 N-（3-碘丙基）氨基甲酸苄酯 − − − 0.22 58 47.755 二十四烷 0.21 − − − 59 47.924 (E)-橙花叔醇 1.68 1.43 2.38 2.38 60 48.133 紫罗兰酮 0.41 0.31 0.24 61 48.944 苯乙醇 0.69 1.84 2.69 0.24 62 49.401 （Z）-己酸-3,7-二甲基-2,6-辛二烯基酯 − − 0.53 − 63 49.405 己酸，3,7-二甲基-2,6-辛二烯-己酸基酯 − − − 0.38 64 50.083 (反式)β-紫罗酮 0.8 1.92 1.32 1.12 65 51.153 2,2,8,8-四甲基3,6-壬二烯-5-酮 − − 0.2 − 66 51.381 (Z)-3-甲基-2-(2-戊烯基)-2-环戊烯酮 1.02 0.56 1.64 1.79 67 51.49 蜂蜡酸甲酯 − − 2.06 − 68 51.502 二十一烷酸甲酯 − 0.92 − − 69 51.949 正二十一烷 0.34 1.6 0.39 0.12 70 52.039 E-环氧法呢烯 0.19 − 0.36 − 71 52.044 （E，E）-2,6,10-三甲基-2,6,9,11-十二四烯醇 − − − 0.51 72 52.407 异植醇 0.12 0.21 0.4 − 73 52.607 α-肟基-苯丙酸 − − − 0.38 74 52.819 雪松醇 0.59 0.27 0.63 0.73 75 53.029 顺式-3-己烯醇苯甲酸酯 − − 0.24 0.33 76 53.04 苯甲酸3-己烯-1-醇酯 − 0.25 -− − 77 53.474 辛酸香叶酯 − − 0.05 − 78 54.272 2-正辛基呋喃 − − 0.22 0.17 79 54.626 己酸苯乙酯 − − − 0.14 80 54.894 4-(2,2,6-三甲基-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基)-3-丁烯-2-酮 − 0.36 0.31 0.45 81 55.62 二十六烷 − 0.65 0.28 − 82 55.594 1-碘三十二烷 − − − 0.25 83 56.705 顺式十八碳-9-烯酸 − − 0.32 − 84 56.695 9-十八烯酸甲酯 − − − 0.64 85 57.096 R,R,R,(E)3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-醇乙酸酯 − − 0.17 − 86 57.362 （Z）-3,7-二甲基八-2,6-二烯-1-十二酸酯 − − 0.13 − 87 57.518 二十五烷 3.73 3.91 2.27 1.12 88 58.566 11,14-二十碳二烯酸甲酯 0.66 0.84 0.92 0.68 89 59.411 戊曲酯 − − 0.22 − 90 60.117 植醇 5.23 − 10.13 4.54 91 60.139 植酮 − 6.61 − − 92 60.961 亚麻酸乙酯 0.38 0.27 0.49 0.3 93 61.676 二十八烷 0.61 0.65 1.51 0.23 94 64.143 3-氧代-2-(2-戊烯基)-环戊乙酸甲酯 − − 0.39 0.23 95 65.869 四十四烷 − 0.54 − − 96 66.574 吲哚 0.36 − 0.68 0.3 97 66.967 四氢-6-(2-戊烯基)-2H-2-吡喃酮 − − − 0.23 98 67.105 邻苯二甲酸二异丁酯 0.44 0.22 0.4 0.4 99 67.867 2-甲基二十八(碳)烷 − 0.25 − − 100 69.896 N-（三氟乙酰基）-花生四烯酰胺 − − − 0.15 101 69.151 2,2'-亚甲基双[6-（1,1-二甲基乙基）]-4-甲基苯酚 − 0.64 − − 102 69.96 甲基二十四(碳)烷 − 0.21 − − 103 71.635 邻苯二甲酸二丁酯 0.45 − 0.24 − 104 71.646 1,2-苯二甲酸丁基2-甲基丙酯 -− 0.12 − − 105 72.409 二氢猕猴桃内酯 − − 0.13 − 106 73.301 二十甲基环十硅氧烷 − − 0.56 − 注：−为未检出物质。
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