The Probiotic Properties of a Strain of Sourdough-derived Lactic Acid Bacteria and Its Effect on the Total Saponins of Acanthopanax senticosus Leaves
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摘要: 为了评价前期分离的一株酸面团源菌株HUCM105的益生特性及其对刺五加叶总皂苷含量的影响，通过形态学特征及16S rDNA基因序列分析鉴定种属，分别于pH2.0、pH2.5和pH3.0的酸性环境及0.5%胆汁环境培养3 h，并监测活菌数变化，于富含胆固醇的培养基中培养24 h并监测胆固醇含量的变化，以评价菌株HUCM105的益生特性，随后以刺五加叶水提液为唯一基质，经菌株HUCM105静置或振荡培养72 h，同时监测活菌数和刺五加叶总皂苷含量的变化。结果表明，菌株HUCM105被鉴定为短乳杆菌，其对酸和胆汁均展现出了良好的耐受性，在pH高于2.5和0.5%胆汁环境下培养3 h活菌数均无明显变化。菌株HUCM105体外培养24 h，可去除培养基中26.4%的胆固醇。菌株HUCM105静置或振荡培养于刺五加叶水提液中24 h时活菌数达到最高值，约为5×108 CFU/mL水平。菌株HUCM105静置培养对刺五加叶总皂苷含量无显著影响，而振荡培养可明显提高总皂苷水平，振荡培养48 h时刺五加叶总皂苷含量最高，达42.6 μg/mL，较未接种菌株提高了79.0%。总之，短乳杆菌HUCM105展现出了良好的酸和胆汁耐受性及降胆固醇的益生特性，在刺五加叶水提液中生长良好，并可提高其总皂苷水平，在开发刺五加叶益生菌发酵产品方面具有潜在的应用价值。Abstract: The purpose of this paper was to evaluate the probiotic properties of a previously isolated strain HUCM105 from sourdough and its effect on the total saponins of Acanthopanax senticosus leaves. The genus and species was identified by the morphological properties and 16S rDNA gene sequences analysis of strain HUCM105. In order to evaluate the probiotic properties, the number of viable bacteria of the strain HUCM105 was monitored at the acidic environment of pH2.0, pH2.5, and pH3.0 and the 0.5% bile environment incubated for 3 h, respectively, and the change of cholesterol content in the cholesterol-rich medium was determined after fermentation of the strain HUCM105 for 24 h. Subsequently, the aqueous extract of Acanthopanax senticosus leaves was used as the sole substrate, and the number of viable bacteria and the total saponin content of Acanthopanax senticosus leaves were measured under static or shaking incubation for 72 h by the strain HUCM105. The results suggested that the strain HUCM105 was identified as Lactobacillus brevis, and exhibited a good tolerance to acid and bile. The number of viable bacteria had no significant changes in a pH value higher than pH2.5 and 0.5% oxgall for 3 h, respectively. Moreover, the strain HUCM105 could remove 26.4% of the cholesterol in the culture medium supplemented with cholesterol after incubation for 24 h. The number of viable cell of the strain HUCM105 was higher and reached the level of 5×108 CFU/mL through the static or shaking incubation at 24 h in the aqueous extract of Acanthopanax senticosus leaves. Static incubation of the strain HUCM105 had no significant effect on the total saponins content of Acanthopanax senticosus leaves, while shaking incubation could significantly increase the total saponins level. The total saponins content of Acanthopanax senticosus leaves was higher when shaking incubation of the strain HUCM105 for 48 h, and reached 42.6 μg/mL, which was 79.0% higher than that of no strain inoculation. In conclusion, it suggested that the strain HUCM105 exhibited probiotic properties including good tolerance to acid and bile and cholesterol removal ability, could grow well in the aqueous extract of Acanthopanax senticosus leaves and increase the total saponins level of Acanthopanax senticosus leaves, and showed a potential application value as a probiotic candidate strain to develop probiotic fermentation products of Acanthopanax senticosus leaves.
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Keywords:
- sourdough /
- Lactobacillus brevis /
- Acanthopanax senticosus /
- saponin /
- probiotic properties
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传统发酵食品，如酸奶、发酵香肠、酸面团等，蕴含着丰富的乳酸菌资源，乳酸菌经口摄入可顺利通过胃酸和胆汁胁迫，并以相当数量活菌进入肠道[1]从而发挥其益生功能，包括降胆固醇[2]、抗糖尿病[3]、抗肥胖[4]、抗抑郁[5]等。微生物因生长速度快、酶系丰富，可高效转化中草药活性成分从而提高药效[6]，近年来作为一般公认为安全（generally recognized as safe, GRAS）的乳酸菌，因安全性高且为益生菌的重要来源而备受关注，其在人参[7]等单味中药，小柴胡汤[8]、四君子汤[9]等中药经典名方的生物转化方面展现出了积极作用。值得注意的是，这些都因菌种及菌株而异。因此，获得具有益生功能且可高效转化药食同源中药有效成分的乳酸菌菌株，进而开发兼具活性益生乳酸菌与高水平药食同源活性物质于一体的保健食品具有重要意义。
刺五加是黑龙江省道地药材，根及根茎均可入药，具有益气健脾、补肾安神之功效。关于刺五加的乳酸菌发酵转化鲜有报道，研究人员发现乳酸菌发酵刺五加可提高其异嗪皮啶含量，降低紫丁香苷水平[10]。然而，刺五加药用根及根茎的过度使用，使其被列为渐危植物，属于国家三级保护野生药材物种，禁止采挖幼株，但刺五加叶为可再生资源，可大量使用，已作为山野菜或加工成茶开发利用，成为当地一种特色农产品[11]。值得关注的是刺五加叶与根部具有类似的化学成分及生物活性，其中皂苷为其主要活性物质之一[12]，故深入挖掘刺五加叶的开发利用途径具有重要意义。以刺五加叶为发酵基质进行乳酸菌发酵尚无相关报道，乳酸菌能否通过生物转化提高刺五加叶皂苷水平仍有待于证实。
鉴于以上考虑，本研究以前期分离的一株可形成溶钙圈的酸面团源分离菌株HUCM105为出发菌株，通过形态学及分子生物学手段对其进行种属鉴定，并进一步评价其益生特性，包括酸和胆汁的耐受性及体外去除胆固醇的能力，同时考察其对刺五加叶水提液为唯一基质的发酵能力，以及发酵后刺五加叶总皂苷含量的变化，旨在为益生菌生物转化刺五加叶总皂苷及二者联合使用开发活性益生菌发酵的保健产品提供理论支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
刺五加叶 采自黑龙江省伊春市丰林县野生刺五加植株嫩叶；菌株HUCM105 分离自黑龙江地区家庭长期使用的传统自然发酵酸面团；胆固醇 美国Amresco公司；牛胆粉 德国Merck公司；齐墩果酸对照品 成都曼思特生物科技有限公司；香草醛 天津市光复精细化工研究所；硝酸铝 天津市巴斯夫化工有限公司；细菌基因组提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂 均为国产分析纯。
SW-CJ-2D超净工作台 苏州净化设备有限公司；DM2500显微镜 上海徕卡显微镜有限公司；SPX-200-II生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；BSD-100振荡培养箱 上海博讯实业有限公司；BXM-30R全自动高压灭菌锅 上海博讯实业有限公司；TGL-16离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SP-752（PC）紫外-可见分光光度仪 上海光谱仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XL-16B 800密封摇摆式粉碎机 广州市旭朗机械设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株的鉴定
菌株HUCM105采用改良MRS（mMRS）固体培养基[13]于37 ℃培养24 h，记录形成菌落的特征，同时进行过氧化氢酶试验，挑取单菌落进行革兰氏染色观察，并记录菌体细胞特征。随后，参照文献[13]的方法进行16S rDNA基因的扩增及测序，并利用MEGA5.1软件与乳杆菌属内模式菌株的16S rDNA基因序列进行比对分析，通过构建系统发育树确定其种属。
1.2.2 酸耐受性测定
菌株HUCM105对酸的耐受性是通过其在酸性条件下的存活情况来评价。菌株HUCM105经mMRS液体培养基连续传代3次以活化，离心收集菌泥，并分别用pH 2.0、pH 2.5或pH 3.0的mMRS液体培养基重悬，37 ℃培养3 h，分别于0、1、2、3 h取样采用平板菌落计数法测定活菌数，从而确定其对酸的耐受能力。
1.2.3 胆汁耐受性测定
菌株HUCM105对胆汁的耐受性是通过其在胆汁环境中的存活情况来评价。传代3次活化的菌株HUCM105发酵液经离心收集菌泥，用含0.5%牛胆汁的mMRS液体培养基重悬，37 ℃培养3 h，采用平板菌落计数法分别检测0、1、2、3 h的活菌数，从而确定其对胆汁的耐受能力。
1.2.4 胆固醇去除能力的测定
菌株HUCM105体外对胆固醇的去除能力，主要是通过其与富含胆固醇培养基共培养前后培养液中胆固醇含量的变化进行评价。简言之，活化的菌株HUCM105按1%接种至含0.3%牛胆汁和100 μg/mL胆固醇的mMRS液体培养基，37 ℃培养24 h，离心得上清液，并测定胆固醇含量，胆固醇含量测定采用邻苯二甲醛法[14]，胆固醇去除率参照文献[15]方法计算。
1.2.5 刺五加叶水提液的制备
刺五加叶阴干并粉碎得刺五加叶干粉。精密称取10.00 g刺五加叶干粉，用100 mL蒸馏水重悬于250 mL锥形瓶中，室温下超声波（500 W，40 kHz）处理1 h，并经121 ℃灭菌15 min得刺五加叶水提液，冷却至室温备用。
1.2.6 刺五加叶水提液的发酵
菌株HUCM105在mMRS液体培养基中连续传代（37 ℃，24 h）2次后，发酵液经离心得菌泥，用等体积PBS缓冲液（pH7.2）洗涤2次，得PBS重悬菌液，并按1%接种至刺五加叶水提液中，分别于37 ℃静置或振荡（80 r/min）培养3 d。
1.2.7 刺五加叶发酵液活菌数的测定
分别于发酵第0、24、48、72 h取菌株HUCM105发酵刺五加叶水提液的发酵液，采用平板菌落计数法测定不同时间点的活菌数。发酵液经适当梯度稀释后涂布于mMRS固体培养基，37 ℃培养24 h后进行菌落计数。
1.2.8 刺五加叶发酵液总皂苷含量的测定
菌株HUCM105发酵刺五加叶水提液期间，分别于发酵第0、24、48、72 h取发酵液，先后经离心及0.45 μm滤膜过滤得滤液，并对滤液中总皂苷含量进行检测。
总皂苷含量的测定参考文献[16]方法，取1 mL滤液水浴挥干，依次加0.5 mL 8%香草醛无水乙醇溶液和5 mL 72%硫酸，振荡混匀并于60 ℃水浴10 min，冷却至室温测定吸光值A542 nm，以齐墩果酸为对照品绘制标准曲线，标准曲线方程为y=0.0063x+0.008，R2=0.9992。
1.3 数据处理
试验数据采用SPSS 17.0软件应用单因素方差分析进行组间比较，每个试验做三个重复，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 菌株HUCM105的鉴定
2.1.1 形态学特征
将菌株HUCM105接种至mMRS固体培养基中，于37 ℃培养24 h，形成的单菌落如图1（A）。单菌落为圆形，边缘完整，低凸，表面光滑，乳白色，不透明，质地黏稠。在菌落表面滴加3%过氧化氢无气泡产生，为过氧化氢酶阴性菌株。挑取单菌落进行革兰氏染色观察，如图1（B），菌株HUCM105为革兰氏阳性，菌体细胞为短杆，单在或成对排列。这些均符合乳酸菌的基本特征。
2.1.2 16S rDNA序列比对分析
菌株HUCM105的16S rDNA基因经测序，获得1488 bp长度的序列，经BLAST后发现与乳杆菌属的同源性最高。从GenBank数据库中获取11株代表性的乳杆菌属内模式菌株的16S rDNA基因序列，以非同属的Escherchia coli模式菌株为外标，利用MEGA5.1软件经两端对齐后进行序列比对分析，并绘制系统发育树，结果如图2所示。
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图 2 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树Figure 2. The phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences由图2可知，菌株HUCM105同Lactobacillus brevis ATCC 14869模式株的亲缘关系最近，序列相似度大于99%，故将HUCM105菌株鉴定为短乳杆菌（L. brevis）。
2.2 菌株HUCM105的酸耐受能力
三种酸性条件pH2.0、pH2.5和pH3.0下，短乳杆菌HUCM105在37 ℃培养不同时间其活菌数的变化情况如图3所示。菌株HUCM105在pH2.5和pH3.0酸性条件下维持3 h，其活菌数均无显著变化（P>0.05），一直维持在109 CFU/mL水平，而pH2.0酸性条件对菌株HUCM105的存活影响较大，处理1 h后存活率降为21.1%，2 h后活菌数仅能维持在103 CFU/mL水平，而培养3 h后则无活菌检出。短乳杆菌HUCM105的酸耐受能力明显优于先前报道的植物乳杆菌HUCM115，后者在pH 2.0条件下处理1 h后存活率仅为4.4%，2 h后则无活菌检出[15]。
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图 3 不同酸性条件下短乳杆菌HUCM105的存活情况注：字母不同表示差异显著（P<0.05），图4同。Figure 3. The viability of Lactobacillus brevis HUCM105 under different acidic conditions2.3 菌株HUCM105的胆汁耐受能力
短乳杆菌HUCM105在0.5%浓度的胆汁环境中培养3 h，每隔1 h培养液中活菌数变化结果如图4所示。整个培养期间，0.5%胆汁处理1 h时活菌数（1.4×109 CFU/mL）最高，与0 h（9.4×108 CFU/mL）差异不显著（P>0.05），但与2 h或3 h相比差异显著（P<0.05）。0.5%胆汁处理2 h与3 h相比，活菌数无显著差异（P>0.05）。菌株HUCM105经0.5%胆汁处理后活菌数先出现微弱增加后降低的趋势，说明培养初期胆汁可能对其生长具有一定的促进作用。0.5%胆汁环境培养3 h后，菌株HUCM105存活率为78.1%，自2 h以后活菌数趋于稳定，一直维持在5.0×108 CFU/mL水平以上，与初始菌数无明显差异（P>0.05），说明0.5%胆汁胁迫处理3 h不会对菌株HUCM105的活力产生影响，短乳杆菌HUCM105对胆汁表现出了良好的耐受能力，与前期报道的植物乳杆菌HUCM115的胆汁耐受能力相当[15]。
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图 4 0.5%胆汁对短乳杆菌HUCM105存活力的影响Figure 4. Effect of 0.5% oxgall on the viability of Lactobacillus brevis HUCM1052.4 菌株HUCM105的胆固醇去除能力
短乳杆菌HUCM105在含胆固醇培养基中37 ℃培养24 h，培养前后培养上清液中胆固醇含量测定结果如表1所示。短乳杆菌HUCM105在富含胆固醇的环境中37 ℃发酵24 h，可去除其中26.4%胆固醇，说明该菌株具有一定的体外降胆固醇特性，且胆固醇去除率较实验室前期报道的植物乳杆菌HUCM115高28.2%[15]。
表 1 短乳杆菌HUCM105的胆固醇去除能力Table 1. Cholesterol removal ability of Lactobacillus brevis HUCM105菌株 胆固醇浓度（μg/mL） 胆固醇去除率（%） 未接种 接种 短乳杆菌HUCM105 106.4±3.4 78.5±11.0 26.4±8.0 2.5 菌株HUCM105发酵刺五加叶的特性
菌株HUCM105以刺五加叶水提液为唯一基质进行发酵，考察刺五加叶发酵期间菌株HUCM105活菌数的变化及其对刺五加叶总皂苷含量的影响，以此评价其对刺五加叶的发酵和转化总皂苷的能力，结果如图5所示。
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图 5 菌株HUCM105发酵刺五加叶的特性注：同种培养方式字母不同表示差异显著（P<0.05）。Figure 5. The properties of Acanthopanax senticosus leaves fermented by the HUCM105 strain菌株HUCM105在刺五加叶水提液中静置或振荡培养24 h时，活菌数均达到最高，静置培养24 h活菌数从初始菌数3.9×107 CFU/mL上升至5.9×108 CFU/mL，随后菌数逐渐降低，至72 h时降为1.9×108 CFU/mL；振荡培养24 h活菌数从初始菌数4.4×107 CFU/mL上升至4.7×108 CFU/mL，随后菌数逐渐降低，至72 h时降为1.5×108 CFU/mL。菌株HUCM105在刺五加叶水提液中静置或振荡培养条件下，其生物量变化趋势及关键节点基本相同，虽然在初始菌数上静置培养稍低于振荡培养，但从不同培养时间点的活菌数水平看，静置培养均略高于振荡培养，这说明菌株HUCM105的生长更适于低氧环境。
菌株HUCM105在刺五加叶水提液中静置培养72 h，不同时间点发酵液中总皂苷含量变化不大，差异不显著（P>0.05）。相比之下，振荡培养条件下随着培养时间的延长发酵液中总皂苷含量变化呈先上升后下降的趋势，发酵液中总皂苷含量最高的时间点并不是出现在活菌数最高的24 h，而是出现在培养48 h，其总皂苷含量达42.6 μg/mL，较初始总皂苷含量提高了79.0%（P<0.05），总皂苷水平最高的时间点滞后于活菌数最高的时间点，这说明菌株HUCM105代谢产生的皂苷转化酶可能具有胞内酶活性，当其处于衰亡期时会释放出更多的胞内皂苷转化酶，从而转化生成更多的皂苷。此外，振荡培养活菌数略低于静置培养，但总皂苷含量却高于静置培养，这可能与振荡培养时乳酸菌细胞与刺五加叶水提液之间接触更为充分从而使酶与底物之间反应更为彻底有关。由此说明，不同培养方式及培养时间对菌株HUCM105发酵刺五加叶总皂苷含量影响较大，菌株HUCM105与刺五加叶水提液经振荡培养可显著提高刺五加叶总皂苷含量，在生物转化刺五加叶总皂苷方面具有潜在的应用价值。
3. 讨论
供试酸面团源菌株HUCM105经形态学特征及16S rDNA序列分析鉴定为短乳杆菌，短乳杆菌是传统发酵酸面团中常见的优势菌种之一[17]，不仅对酸面团的质构及风味起积极作用[18]，而且具有潜在的益生功能[19-20]。益生菌若能在体内发挥作用，则需要以相当活菌数量进入人体肠道。消化道胁迫环境被认为是益生菌顺利进入肠道的一道屏障，故酸和胆汁通常被用于体外评价益生菌对消化道的抵抗能力[21]。短乳杆菌HUCM105在pH2.5以上的酸性环境孵育3 h，其活菌数无明显变化，展现出了良好的酸耐受性，其对酸的耐受能力明显优于Mancini等[22]报道的两株短乳杆菌，pH2.5条件下处理3 h后，短乳杆菌DSM 32386的活菌数下降了两个数量级，而短乳杆菌DSM 20054则无活菌检出。短乳杆菌对胆汁的耐受能力因菌株而异，Vasiee等[23]从意大利传统发酵食品中分离的4株短乳杆菌中，只有3株能在0.5%胆酸盐环境中生长，而奶酪源短乳杆菌DSM 32386经0.3%胆汁处理3 h后活菌数从105下降到102水平[22]，相比之下，短乳杆菌HUCM105在0.5%胆汁环境中培养3 h，活菌数无显著变化，表现出良好的耐受性。由此推测，短乳杆菌HUCM105可抵抗消化道胁迫作用，并以相当活菌数量顺利进入肠道进而发挥其益生作用。
近年来，已有大量临床研究显示乳酸菌在降低人体血清胆固醇水平上具有积极作用[24]，体外试验因周期短且操作简便而通常作为筛选体内具有降胆固醇作用乳酸菌的先决条件。短乳杆菌HUCM105在富含胆固醇培养基中生长24 h可去除四分之一以上的胆固醇，可作为潜在候选降胆固醇菌株，其降胆固醇能力略低于姜华等[25]报道的短乳杆菌JH-1，而Watanabe等[19]报道的8株短乳杆菌中，只有3株胆固醇去除率超过20%，这也说明了短乳杆菌的降胆固醇特性存在菌株特异性。
中药的微生物转化作用，体现了中药现代化[26]。乳酸菌之所以被选择用于转化中药，与其高安全性有直接关系，其在单味药及经典方剂的生物转化方面取得了一定进展[7-8,27-28]。然而，关于乳酸菌生物转化刺五加的研究鲜有报道，而开发具有类似化学成分且可再生的刺五加叶，对保护中药刺五加资源尤为重要，故以刺五加叶为研究对象，选取了植物基来源的菌株HUCM105，试图探寻其发酵刺五加叶的可能性并考察其对刺五加叶总皂苷含量的影响，以期为开发兼具活性乳酸菌与刺五加叶皂苷的发酵产品提供理论支持，结果表明供试菌株HUCM105可以刺五加叶水提液为唯一发酵基质，维持较高水平的活菌数量，且振荡培养可提高刺五加叶总皂苷水平。刺五加叶皂苷具有降血脂作用[29]，故短乳杆菌HUCM105发酵刺五加叶产品在降血脂方面可体现双重叠加效果，不仅可通过短乳杆菌HUCM105自身的降胆固醇作用，也可通过其发酵促进刺五加叶总皂苷生成途径提高降血脂功效，具有广阔的开发前景。短乳杆菌HUCM105促生皂苷的机制源于何种关键酶作用[30]尚有待于进一步研究。此外，已有研究表明短乳杆菌具有一定的糖苷酶活性，可使人参皂苷原型去糖基化转化为稀有皂苷CK[7]，后者为小分子皂苷，肠道内更易吸收而发挥药效[31]，短乳杆菌HUCM105能否将刺五加叶皂苷原型转化为更易吸收的小分子皂苷仍需进一步深入研究加以确定。
总之，酸面团源短乳杆菌HUCM105可耐受酸和胆汁胁迫，并具有降胆固醇作用，同时可以刺五加叶水提液为唯一发酵基质，维持较高活菌数量并可提高刺五加叶总皂苷水平，可作为候选益生菌株用于发酵刺五加叶提高其功效，进而为益生菌发酵刺五加叶产品的开发提供理论支持。
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图 2 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树
Figure 2. The phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences
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图 3 不同酸性条件下短乳杆菌HUCM105的存活情况
注：字母不同表示差异显著（P<0.05），图4同。
Figure 3. The viability of Lactobacillus brevis HUCM105 under different acidic conditions
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图 4 0.5%胆汁对短乳杆菌HUCM105存活力的影响
Figure 4. Effect of 0.5% oxgall on the viability of Lactobacillus brevis HUCM105
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图 5 菌株HUCM105发酵刺五加叶的特性
注：同种培养方式字母不同表示差异显著（P<0.05）。
Figure 5. The properties of Acanthopanax senticosus leaves fermented by the HUCM105 strain
表 1 短乳杆菌HUCM105的胆固醇去除能力
Table 1 Cholesterol removal ability of Lactobacillus brevis HUCM105
菌株 胆固醇浓度（μg/mL） 胆固醇去除率（%） 未接种 接种 短乳杆菌HUCM105 106.4±3.4 78.5±11.0 26.4±8.0 
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